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研究背景围产期和婴幼儿早期可谓是机体大脑发育的关键时期。在该关键性发育期内,大脑神经元迅速地增殖和分化,彼此形成许多突触连接,最终发育成复杂的中枢神经系统。然而,在此期间,环境压力会极大地影响大脑发育。例如,需要进行手术干预的儿童会接触到很多压力源:精神、疼痛、炎症和麻醉,这些可能会影响其大脑和行为的发育。2016年美国FDA(Food and Drug Administration)发布警告:妊娠末三个月的孕妇或三岁以下儿童在手术中重复或长时间(>3小时)使用全麻药和镇静药,可能会影响胎儿及儿童的大脑发育。婴幼儿围术期麻醉引起神经系统损伤及功能紊乱已经成为全世界关注的临床及社会问题。七氟醚是婴幼儿麻醉中最常用的吸入麻醉药物,近年来,越来越多的研究报道,七氟醚可诱导发育期大脑的认知障碍,其中包括社会交往障碍,手术创伤亦能引起认知障碍。而具体机制尚不明确,并亟待解决,以便指导临床合理化治疗。第一部分1.研究目的评估新生期C57/BL6小鼠接受七氟醚麻醉,及接受七氟醚麻醉复合手术,对其社会交往行为的影响。2.实验方法(1)动物模型的选取:研究发现小鼠(C57BL/6J),具备较好的社会交往倾向和社会新奇偏好。因此,本实验选取出生第7天的C57BL/6J小鼠。(2)动物模型的建立:(1)麻醉组:新生期(7天)C57BL/6J小鼠“吸入3%七氟醚+60%氧气”2小时(室温维持22-25℃);(2)手术组:新生期(7天)C57BL/6J小鼠“吸入3%七氟醚+60%氧气”2小时+腹腔探查手术(室温维持22-25℃);(3)对照组:新生期(7天)C57BL/6J小鼠“吸入60%氧气”2小时(室温维持22-25℃)。造模结束后,新生期C57BL/6J小鼠返笼,由母鼠喂养。第30天测试每组C57BL/6J小鼠的社交能力。(3)社交能力测试(三室社会交往模型):第1阶段是适应期(Habituation):首先将被测试小鼠放在中央房间,两侧门呈开放状态。两侧房间内各放有一只相同的铁笼,小鼠可在各个房间自由穿梭适应环境。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,以及其主动嗅探空铁笼的时间和次数,此测试阶段为5分钟。第2阶段测试社会交往倾向(Sociability):将第1只陌生同类装入铁笼内,再观察被测试小鼠自由活动和主动接触陌生同类的行为。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,以及其主动嗅探陌生同类或空铁笼的时间和次数,此测试阶段为10分钟。第3阶段测试社会新奇偏好(Social Novelty):将第2只新来陌生同装入对侧房间铁笼内,再观察被测试小鼠自由活动和主动接触陌生同类的行为。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,被测试小鼠自由活动和主动接触“新来”或“原有”陌生同类的时间和次数,此测试阶段为10分钟。获得实验数据后,分析各行为参数的意义和相关性。3.实验结果麻醉复合手术组在幼年期(第30天)社会交往行为被部分抑制:社会交往倾向性方面表现正常,被测子代小鼠接触陌生鼠1的时间远大于接触空笼子的时间(Control:P<0.0001;Anesthesia:P<0.05;Surgery:P<0.001);社会新奇偏好方面,社会新奇性明显下降(Control:P=0.01;Anesthesia:P=0.001;Surgery:P=0.17)。4.结论新生期C57BL/6J小鼠吸入3%七氟醚2小时复合剖腹探查术,在幼年期(第30天)其社会交往行为被抑制,并诱发认知障碍。第二部分1.研究目的评估成年初期C57/BL6小鼠接受七氟醚麻醉,及接受七氟醚麻醉复合手术,对其社会交往行为的影响。2.实验方法(1)动物模型的选取:研究发现小鼠(C57BL/6J),具备较好的社会交往倾向和社会新奇偏好。因此,本实验选取成年初期,即第60天的C57BL/6J小鼠。(2)动物模型的建立:(1)麻醉组:成年初期(60天)C57BL/6J小鼠“吸入3%七氟醚+60%氧气”2小时(室温维持22-25℃);(2)手术组:成年初期(60天)C57BL/6J小鼠“吸入3%七氟醚+60%氧气”2小时+腹腔探查手术(室温维持22-25℃);(3)对照组:成年初期(60天)C57BL/6J小鼠“吸入60%氧气”2小时(室温维持22-25℃)。造模结束后的第1、3、7天,测试每组C57BL/6J小鼠的社交能力。(3)社交能力测试(三室社会交往模型):第1阶段是适应期(Habituation):首先将被测试小鼠放在中央房间,两侧门呈开放状态。两侧房间内各放有一只相同的铁笼,小鼠可在各个房间自由穿梭适应环境。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,以及其主动嗅探空铁笼的时间和次数,此测试阶段为5分钟。第2阶段测试社会交往倾向(Sociability):将第1只陌生同类装入铁笼内,再观察被测试小鼠自由活动和主动接触陌生同类的行为。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,以及其主动嗅探陌生同类或空铁笼的时间和次数,此测试阶段为10分钟。第3阶段测试社会新奇偏好(Social Novelty):将第2只新来陌生同装入对侧房间铁笼内,再观察被测试小鼠自由活动和主动接触陌生同类的行为。Anymaze软件自动记录其进出各个房间的时间和次数,被测试小鼠自由活动和主动接触“新来”或“原有”陌生同类的时间和次数,此测试阶段为10分钟。获得实验数据后,分析各行为参数的意义和相关性(4)应用Western blotting方法检测C57BL/6J小鼠脑内海马区PSD95的表达水平。3.实验结果麻醉组在七氟醚暴露后一天里,其社会交往行为被抑制:社会交往倾向性方面表现正常,即被测子代小鼠接触陌生鼠1的时间远大于接触空笼子的时间(Baseline:P<0.0001;Day1:P<0.0001;Day3:P<0.05;Day7:P<0.001);社会新奇偏好方面,社会新奇性明显下降,即被测子代小鼠接触陌生鼠1的时间与接触陌生鼠2的时间无差异(Baseline:P<0.01;Day1:P=0.4212;Day3:P<0.01;Day7:P<0.01)。麻醉复合手术组在术后一周里,社会交往行为被抑制:社会交往倾向性方面表现正常,即被测子代小鼠接触陌生鼠1的时间远大于接触空笼子的时间(Baseline:P<0.0001;Day1:P<0.05;Day3:P<0.05;Day7:P<0.001);社会新奇偏好方面,社会新奇性明显下降,即被测子代小鼠接触陌生鼠1的时间与接触陌生鼠2的时间无差异(Baseline:P<0.01;Day1:P=0.4403;Day3:P<0.01;Day7:P=0.068)。4.结论成年早期C57BL/6J小鼠吸入3%七氟醚,会抑制其社会交往行为,但这种现象只是短暂的,而C57BL/6J小鼠吸入3%七氟醚复合剖腹探查术会抑制其社会交往行为,且这种现象具有持续性,即至少持续七天。