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目的:通过支气管镜氩等离子体凝固(argon plasma coagulation,APC)方法建立支气管狭窄动物模型,而后应用新型冷冻探针进行冷冻治疗,进而评价新型冷冻探针对支气管狭窄的治疗效果以及冷冻机制探讨,为后期新型冷冻探针进行临床人体试验提供理论依据。方法:本研究所使用的新型冷冻探针区别于常规冷冻探针,探针前端具有一定的弯曲角度,并具有超弹性、记忆性和可自复性,已经完成对新型冷冻探针自弯曲角度触及范围的动物实验验证,本次研究主要进行对其冷冻治疗效果的验证及冷冻机制研究,为新型冷冻探针进行临床人体试验奠定基础。总计24只健康比格犬,首先从中随机选取12只比格犬进行支气管狭窄动物模型建立。在动物模型建立成功的前提下,对剩余12只比格犬重复支气管狭窄模型的建立,而后进行冷冻治疗实验的研究。1.动物模型建立(1)将12只比格犬随机分为模型A组(术后第7天处死)、模型B组(术后第14天处死),每组6只;(2)使用支气管镜下APC方法对12只比格犬左、右侧支气管进行烧灼;(3)分别于APC术后第7天、第14天进行支气管镜观察,同时镜下测量支气管管径,进行统计学分析;(4)模型A组于APC术后第7天取支气管大体标本,模型B组于APC术后第14天取支气管大体标本,同时对同一分支的正常支气管取材,行HE染色、胶原纤维染色,并检测胶原纤维面积百分比,进行统计学分析。2.新型冷冻探针冷冻治疗效果及其机制研究(1)按照自身对照原则,对余下12只比格犬进行重复支气管狭窄动物模型建立;(2)在APC术后第7天对12只比格犬右侧支气管进行冷冻治疗,左侧支气管作为对照,同时行支气管镜观察并测量支气管管径;于APC术后第14天(冷冻治疗后第7天),再次进行支气管镜下观察,同时测量支气管管径,并进行统计学分析;(3)12只比格犬于APC术后第14天(冷冻治疗后第7天)取支气管大体标本,行HE染色、胶原纤维染色,并检测胶原纤维面积百分比,进行统计学分析;(4)使用CD34免疫组织化学的方法检测在支气管组织中微血管新生情况,以微血管密度(microvessel density,MVD)作为指标计数,并进行统计学分析;(5)使用免疫组织化学方法检测白介素-17(interleukin-17,IL-17)、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在各组支气管组织中的表达,以平均光密度(mean optical density,MOD)计数,并进行统计学分析。结果:1.动物模型建立(1)支气管镜观察:APC烧灼即时,支气管管口组织呈白色、干燥状;APC术后第7天,支气管管口被肉芽组织堵塞,伴有支气管周围组织肿胀;APC术后第14天,支气管管口可见瘢痕组织形成。(2)支气管管径测量:APC术前支气管管径、APC术后第7天、APC术后第14天支气管管径(不论左侧、右侧)两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);同期左侧与右侧支气管管径比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)支气管大体标本观察:APC术后第7天,在支气管管口可见肉芽组织增生,组织水肿;APC术后第14天,支气管管周有损伤性瘢痕形成。(4)组织学观察:(1)光镜病理:APC术后第7天,黏膜上皮脱落,黏膜下可见坏死组织,肉芽组织增生,伴有水肿、淋巴细胞、中性粒细胞,损伤侵及平滑肌层,未达软骨层;APC术后第14天,黏膜上皮增生,黏膜下可见中性粒细胞、淋巴细胞,肉芽组织减少;(2)胶原纤维增生情况:APC术后第14天胶原纤维较术后第7天丰富,且APC术前、术后第7天、术后第14天胶原纤维面积百分比两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.新型冷冻探针冷冻治疗效果及其机制研究(1)支气管镜观察:冷冻治疗作用于肉芽组织,即时效果显著,观察到支气管管口变大;APC术后第14天(冷冻治疗后第7天),治疗侧支气管肉芽组织减少;对照侧支气管周边可见瘢痕组织。(2)支气管管径测量:APC术前支气管管径、APC术后第7天、APC术后第14天(冷冻治疗后第7天)对应支气管管径两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);同期治疗侧与对照侧支气管管径比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)支气管大体标本观察:治疗侧支气管管口肉芽组织减少,表面较平整;对照侧支气管管周有瘢痕形成,欠平整。(4)组织学观察:(1)光镜病理:治疗侧支气管黏膜下可见水肿、毛细血管、中性粒细胞、淋巴细胞;对照侧支气管黏膜下可见毛细血管、中性粒细胞、淋巴细胞;(2)胶原纤维增生情况:对照侧胶原纤维较治疗侧丰富、密集,且治疗侧胶原纤维面积百分比较对照侧低(t=7.89,P<0.05);(3)MVD测量结果:治疗侧MVD较对照侧支气管组织中低(t=6.64,P<0.05);(4)MOD测量结果:治疗侧支气管组织中IL-17、VEGF-A及TGF-β1 MOD较均对照侧低(P<0.05)。结论:1.通过支气管镜介导使用APC方法建立支气管狭窄动物模型是一项简便快捷、安全的技术,可为支气管狭窄治疗方法的探索提供一种稳定的实验动物模型。2.冷冻治疗前后支气管管径虽差异不显著,但从支气管镜下观察、支气管大体标本形态、光镜病理组织学等方面结果显示新型冷冻探针对肉芽组织增生所致的支气管狭窄有效,此外,IL-17、VEGF-A、TGF-β1在支气管组织中表达结果说明冷冻可减轻炎症反应、肉芽组织增生。在冷冻过程中,是否有其他因子共同参与反应,尚待进一步研究。3.新型冷冻探针冷冻效果较佳,未出现不良反应,为后期进行临床人体试验提供了实验数据。