论文部分内容阅读
目的筛选分析癌症基因组图谱(The cancer genome atlas,TCGA)数据库中,与正常肝组织相比在肝癌组织中差异表达的MicroRNAs(miRNAs),细胞表型实验检测差异表达的miRNAs(Different expression miRNAs,DEM)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结合生物信息学方法预测并筛选差异表达miRNAs的候选靶基因,并验证miR-33b-5p对靶基因基质金属蛋白酶16(Matrix metalloproteinase-16,MMP16)的作用,进一步验证miR-33b-5p调控肝癌细胞增殖和迁移的分子机制,为肝癌的分子机制及其早期诊断提供有力的理论依据。方法1通过TCGA数据库对肝癌患者进行分析,筛选出具有差异表达的miRNAs,对其中差异表达最明显的miRNAs进行物种保守性的分析,将物种保守性较高的miRNAs进行生存曲线的分析,筛选出与总生存率相关的miRNAs在肝癌患者不同临床分期中的表达。2选择正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2和SMMC-7721,应用qRT-PCR检测miR-767-5p、miR-183-5p、miR-184、miR-205-5p、miR-1258、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p的表达水平;3实验分为对照组(NC)、miRNAs mimics组和miRNAs inhibitor组,应用CCK8实验检测各组肝癌细胞的增殖能力,应用Transwell实验检测miR-33b-5p对肝癌细胞迁移和侵袭的影响。4应用三个生物信息学网站(miRWalk、Target Scan和miRDB)预测miR-33b-5p的候选靶基因,筛选出候选靶基因MMP16并应用荧光素酶实验验证。5利用qRT-PCR和Western blot分别检测肝癌细胞HepG2中MMP16的mRNA和蛋白表达水平。结果1通过对TCGA数据库中临床肝癌组织的数据分析筛选出506个差异表达的miRNAs,对其中差异表达最明显的26个miRNAs进行物种保守性的分析,筛选出12个物种保守性较高的miRNAs进行生存曲线分析,结果显示8个miRNAs(miR-767-5p、miR-183-5p、miR-184、miR-205-5p、miR-1258、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p)与预后有关,进一步分析8个miRNAs在不同临床分期的肝癌患者中的表达,结果显示8个miRNAs在肝癌不同TNM分期中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。2 qRT-PCR实验结果显示:与正常肝细胞LO2相比,在肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中,miR-767-5p和miR-183-5p高表达,而miR-184、miR-205-5p、miR-1258、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p低表达,差异有统计学意义(P<0.05)。3 CCK8实验结果显示:与转染NC mimic组相比,转染miR-767-5p、miR-1258促进肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖能力,而转染miR-183-5p、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p抑制肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖能力;与转染NC inhibitor相比,转染miR-767-5p、miR-1258抑制肝癌细胞增殖能力,而转染miR-183-5p、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p促进肝癌细胞增殖能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Transwell迁移和侵袭结果显示:与转染NC mimic组相比,miR-33b-5p抑制肝癌细胞HepG2迁移和侵袭能力;与转染NC inhibitor组相比,miR-33b-5p促进肝癌细胞HepG2迁移能力和侵袭能力,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4应用三个生物信息学网站(miRWalk、Target Scan和miRDB)预测miR-33b-5p的候选靶基因有130个,依据生物信息学网站和相关文献筛选出MMP16作为miR-33b-5p的候选靶基因。荧光素酶实验显示:与PGL3-MMP16-mut+miR-33b-5p mimic相比,PGL3-MMP16-wt+miR-33b-5p mimic的荧光素酶活性显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),实验结果证实MMP16是miR-33b-5p的直接靶基因。5 qRT-PCR和Western blot结果显示,在肝癌细胞HepG2中,与NC mimic组比较,miR-33b-5p mimic组中MMP16的mRNA和蛋白表达水平下降,与NC inhibitor组比较,miR-33b-5p inhibitor组中MMP16的mRNA和蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1 miR-767-5p、miR-1258促进肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖能力,miR-183-5p、miR-490-3p、miR-139-5p、miR-33b-5p抑制肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖能力。2 miR-33b-5p抑制肝癌细胞HepG2迁移和侵袭的能力。3 miR-33b-5p可以负向调节肝癌细胞HepG2中MMP16 mRNA和蛋白的表达水平,提示MMP16是miR-33b-5p的直接靶基因,miR-33b-5p可能通过靶定MMP16起到抑癌基因的作用。图36幅;表15个;参94篇。