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背景:糖尿病神经病变和心血管病变是糖尿病常见又严重的并发症,一旦发生很难逆转,但至今其发病机制仍不明确。以往的研究主要集中在糖尿病高血糖对神经元和心肌细胞的损伤作用,而糖尿病病变中脂肪酸的影响往往容易被忽视。我们的研究发现辣椒素受体(transient receptor potential vanilloid type1,TRPV1)在糖尿病大鼠背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)和心肌的表达量显著降低,饮食中给予辣椒或者辣椒素缓慢激活TRPV1,可以明显改善糖尿病大鼠神经病变和心肌缺血-再灌注损伤的易损性;降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物质(substance P,SP)体外作用也可以保护心肌的缺氧复氧损伤,因此,TRPV1-CGRP/SP的激活在糖尿病神经病变和心血管病变中发挥了重要的保护作用。同时根据文献报道,糖尿病患者体内升高的脂肪酸中有些具有抑制TRPV1的作用,那么这部分脂肪酸对糖尿病神经病变和心肌缺血-再灌注损伤是否具有损伤作用,其作用是否通过抑制TRPV1-CGRP轴,从而抑制了机体的保护作用,具体的作用机制是什么?这是我们实验的主要目的。本实验主要通过对文献中发现报道的糖尿病人体内增多的脂肪酸做筛选,并验证其对TRPV1的作用。用相应的脂肪酸作用于糖尿病大鼠的DRG神经元和对心脏进行体外缺血-再灌注,观察DRG神经元的生长情况和心肌功能的变化,最后进一步探讨其可能的作用机制。目的:(1)检测不同浓度的油酸(oleic acid,OA)对DRG神经元TRPV1通道的作用。(2)用OA作用于糖尿病神经病变大鼠DRG神经元,检测其对TRPV1及其下游降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质(SP)以及神经生长因子(NGF)的表达的影响。同时检测DRG神经元氧化应激损伤、线粒体功能、凋亡和轴突的生长情况。用辣椒素(capsaicin)激活TRPV1,检测是否能逆转OA的作用。(3)因为capsaicin激活TRPV1后会刺激释放CGRP,那么CGRP对糖尿病神经病变大鼠DRG神经元是否有保护作用?通过外源性给予CGRP或者慢病毒介导的过表达CGRP后,检测SP和NGF的表达;同时检测糖尿病DRG神经元氧化应激、凋亡、线粒体膜电位和轴突生长情况。(4)用OA体外灌流正常大鼠的心脏,并进行缺血-再灌注(I/R),检测心功能的变化。进一步给予PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002,简单说明TRPV1在大鼠心脏I/R的作用机制。方法:(1)分离正常和糖尿病成年SD大鼠DRG,原代培养DRG神经元细胞。用钙成像(Fluo4-AM离子探针)的方法检测不同浓度的capsaicin和OA对DRG神经元内Ca2+浓度变化的影响。(2)用STZ诱导产生糖尿病大鼠模型,分离培养其DRG神经元,用capsaicin和OA作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤(LDH检测)、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(JC-1)和凋亡(TUNEL)以及轴突的生长情况(anti-βⅢtubulin antibody);最后检测TRPV1、CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况(PCR、western blot和ELISA)。(3)用过表达CGRP的慢病毒(LV-CGRP)或者体外给予CGRP作用于糖尿病大鼠DRG神经元,检测DRG细胞损伤(LDH检测)、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(JC-1)和凋亡(TUNEL)以及轴突的生长情况(anti-βⅢtubulin antibody),最后检测CGRP、SP和NGF的m RNA和蛋白的表达情况(PCR、ELISA)。(4)采用Langendorff灌流装置进行离体心脏缺血-再灌注(停灌30min,复灌60min)。给予OA、capsaicin和PI3K的抑制剂LY294002,记录缺血-再灌注后心脏功能:左心室主动收缩压(left ventricular development pressure,LVDP),左室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP),心率(heart rate,HR),左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)以及室性心律失常的发生情况(室性早搏、室速和室颤)。同时检测心肌缺血区PI3K/Akt通路中p-Akt的表达情况(western blot)。结果:(1)体外原代培养大鼠DRG神经元,用PGP9.5对DRG神经元进行鉴定,可以发现DRG神经元生长良好,细胞贴壁后慢慢长出轴突。并且TRPV1和CGRP、SP、NGF在DRG神经元上都有共表达。(2)体外分离、培养正常和糖尿病大鼠DRG神经元,培养24h后进行Ca2+成像。在正常大鼠DRG神经元中,10-7,10-6,10-5 mol/L的辣椒素(capsaicin,Cap)可以浓度依赖性地升高细胞内Ca2+浓度(P<0.001)。用最适浓度10-6 mol/L的Cap分别作用于正常和糖尿病大鼠DRG神经元,糖尿病大鼠DRG神经元内Ca2+浓度增加小于正常大鼠DRG神经元,也验证了糖尿病大鼠DRG中TRPV1的表达减少。先用5×10-8,5×10-7,5×10-6mol/L的油酸(oleic acid,OA)和10-6mol/L辣椒平(capsazepine,Cpz)分别作用于正常大鼠DRG神经元,5×10-6mol/L的OA和10-6mol/L Cpz的作用类似,细胞内Ca2+浓度变化没有明显差别(P>0.05)。相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA均可以升高细胞内Ca2+浓度(P<0.001)。接着给予10-6mol/L Cap,TRPV1受体近一步被激活。Cpz和5×10-6mol/L的OA在Cap作用后,细胞内Ca2+浓度均没有明显的变化(P>0.05);相对于Cpz和5×10-6mol/L的OA,5×10-8,5×10-7mol/L的OA在Cap作用下,细胞内Ca2+浓度均明显升高(P<0.001)。说明低浓度的OA对TRPV1有一定的激活作用,高浓度的OA作用类似TRPV1的拮抗剂Cpz,对TRPV1受体有抑制作用。(3)OA对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:糖尿病大鼠DRG神经元培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)浓度升高(P<0.01),活性氧(ROS)生成增多(P<0.01),线粒体膜电位(MMP)降低(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),DRG神经元轴突增生受损(P<0.01),再生能力减弱。同时TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达不论在蛋白还是m RNA水平均减少(P<0.05)。10-6 mol/L的Cap可以缓解糖尿病大鼠DRG神经元的损伤(P<0.05),拮抗剂辣椒平(capsazepine,Cpz)可以取消capsaicin的保护作用(P>0.05)。用5×10-6mol/L的OA作用于糖尿病DRG神经元,神经元的损伤没有进一步的增加(P>0.05),但是用Cap作用后,Cap的保护作用消失(P>0.05);TRPV1、CGRP、SP和NGF的表达在蛋白和m RNA水平也没有增加(P>0.05)。说明5×10-6mol/L的OA发挥了类似TRPV1拮抗剂的作用,取消了Cap激活TRPV1后对糖尿病大鼠DRG神经元的保护作用。(4)CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的作用:用外源性10-8mol/L的CGRP作用于糖尿病DRG神经元,可以改善糖尿病DRG神经元的损伤,使得细胞的损伤减少(P<0.05),ROS的生成减少(P<0.01),升高MMP(P<0.05),神经元凋亡率减少(P<0.01),轴突增生增加(P<0.01);同时10-7mol/L拮抗剂CGRP8-37可以取消CGRP的保护作用(P>0.05)。那么CGRP的作用是否依赖于SP和NGF呢,用LV-CGRP感染糖尿病DRG神经元,DRG神经元的损伤减小(P<0.01),轴突的增生增加(P<0.01),同时检测SP和NGF的表达,SP和NGF的m RNA和蛋白的表达都没有明显的增加(P>0.05)。说明CGRP对糖尿病大鼠DRG神经元的损伤具有保护作用,并且其保护作用不依赖SP和NGF。(5)OA缺血预处理对离体大鼠心脏I/R的影响:在缺血前,10-6 mol/L Cap作用后心脏LVDP、HR和±dp/dtmax明显增加(P<0.01),LVEDP降低(P<0.01);5×10-6mol/L OA作用后LVDP、HR和±dp/dtmax明显降低(P<0.05),LVEDP增加(P<0.05),再给予10-6 mol/L Cap,可以抑制OA对心功能的影响(P>0.05)。再灌注后Cap明显改善I/R对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax明显升高(P<0.01),LVEDP降低(P<0.01)。同时Cap可以改善OA对心功能的损伤,LVDP、HR和±dp/dtmax降低(P<0.05),LVEDP升高(P<0.05)。先给予PI3K的拮抗剂LY294002,再给予Cap,发现Cap的保护作用被取消(P>0.05)。在整个I/R期间,10-6 mol/L Cap作用后,室性早搏的发生次数增加(P<0.05),室速和室颤的发生次数没有明显的变化(P>0.05);5×10-6mol/L OA单独作用后,室性早搏的发生次数明显增加(P<0.01),室速和室颤的发生次数增加(P<0.05);在OA的基础上再给予Cap,心脏室性早搏(P<0.01)、室速(P<0.01)和室颤(P<0.05)的发生次数均减少。和单独给予Cap相比,给予LY294002后再给予Cap,室性早搏的发生次数减少(P<0.05)。检测心肌缺血区p-Akt的表达,Cap作用后p-Akt的表达增加(P<0.01),OA和LY294002均可以抑制capsaicin诱导的p-Akt的增加(P<0.01)。说明OA可以通过抑制TRPV1-CGRP轴,抑制PI3K/Akt信号通路,从而加重心肌I/R损伤。结论:(1)OA对TRPV1的作用与浓度有关,低浓度可以轻度激活TRPV1,高浓度抑制TRPV1。(2)糖尿病神经病变大鼠DRG神经元中,TRPV1以及其下游的感觉神经肽CGRP、SP和NGF的表达减少,外源性的给予capsaicin可以改善糖尿病DRG神经元的氧化应激损伤,促进轴突再生。外源性给予大剂量的OA,并不加重糖尿病DRG神经元的损伤,但是减弱了TRPV1激活后的保护作用。(3)CGRP可以保护糖尿病神经病变DRG神经元,并且保护作用并不通过SP和NGF发挥作用。(4)正常大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤中,OA可以加重损伤,并且抑制capsaicin激活TRPV1对I/R损伤的保护,其作用可能是通过PI3K/AKT信号通路来实现的。综上所述:大剂量的OA可以抑制TRPV1受体,从而抑制了TRPV1-CGRP轴激活后对糖尿病大鼠神经病变和心脏缺血-再灌注损伤的保护作用,可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现的。