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目的为了探究胸腺来源的iNKT细胞过继治疗RA小鼠的免疫学机制问题,(1)我们构建了RA小鼠模型,分析iNKT细胞频率及亚群、Th细胞亚群及细胞因子的变化;(2)通过α-Galcer注射,诱导小鼠胸腺iNKT细胞增殖,获取具有特定功能的胸腺iNKT细胞;(3)过继输注至RA模型小鼠,观察治疗效果;(4)探究iNKT细胞调控RA模型小鼠体内免疫失衡的机制,为RA细胞过继治疗提供基础性研究数据。方法1.类风湿关节炎(RA)小鼠模型的构建及鉴定hGPI325-339和hGPI469–483多肽片段以1:1比例混合,与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后,于DBA/1小鼠尾根部皮下多点注射,百日咳毒素0 h、48 h腹腔注射加强免疫进行造模。以健康小鼠为对照,观测小鼠体重及足踝关节正常情况的变化;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察足踝关节炎性细胞的浸润情况;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测外周血、胸腺、脾脏iNKT细胞频率及iNKT1/iNKT2亚群、Th1/Th2/Th17亚群比率,微量样本多指标蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测血清细胞因子(如IL-4、IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-2)水平的变化。2.胸腺来源的iNKT细胞的定向诱导及免疫生物学功能检测和安全性评价DBA/1小鼠于尾根部皮下单次注射α-GalCer(2μg/只)为α-GalCerⅠ组,尾根部皮下多次注射α-GalCer(2μg/只,48h/次,3次)为α-GalCerⅡ组,尾根部皮下注射等量PBS注射为健康对照组,FCM检测胸腺中iNKT频率和亚群变化,免疫磁珠分选技术(Magnetic Cell Sorting,MACS)分离纯化小鼠胸腺iNKT细胞,CBA检测iNKT细胞刺激上清中细胞因子的分泌,用细胞膜荧光探针(DiR)标记细胞,尾静脉输注至正常小鼠,小动物活体成像系统观察细胞定居迁移变化,并对小鼠体重、皮毛、皮肤、活动和姿势进行评价,确定细胞输注的安全性。3.胸腺来源的iNKT细胞过继输注到RA小鼠体内后治疗效果的观测及机制探讨应用胸腺来源的iNKT细胞对RA模型小鼠进行治疗,以α-Gal Cer作为阳性对照,观察各组小鼠体重和足踝关节肿胀的变化情况;关节组织HE染色法观察炎细胞浸润情况的变化;FCM检测iNKT细胞频率、iNKT细胞亚群及Th细胞亚群变化,CBA检测各组小鼠不同时期血清中细胞因子水平变化,Wester blot检测各组小鼠胸腺及脾脏中关键蛋白表达量的差异。结果1.RA组小鼠较control组体重增长缓慢(P<0.05),在造模第6天,足趾出现红肿,造模第14天红肿达到高峰,后逐渐缓解;HE观察发现造模第14天,RA小鼠足踝关节有大量炎细胞浸润。FCM检测发现炎症高峰期RA小鼠外周血、胸腺、脾脏中iNKT细胞频率均显著下降(P<0.05);炎症早期RA小鼠胸腺、脾脏中的iNKT1亚群频率显著增高,脾脏Th1和Th17亚群显著增多(P<0.05),炎症中后期Th2亚群上升明显(P<0.05);炎症高峰期血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平显著升高(P<0.05)。2.α-GalCer单次尾根部皮下注射后,小鼠胸腺中iNKT频率第8天达高峰,频率为16%左右;α-GalCer多次尾根部皮下注射后,第2天小鼠胸腺iNKT频率最高,频率为10%左右,随后逐渐下降。α-GalCer单次尾根部皮下注射后第8天,iNKT1亚群的频率达最小值,频率为0.31%左右,iNKT2亚群频率达高峰,频率为50%左右。MACS纯化α-GalCer单次尾根部皮下注射后第8天的小鼠胸腺iNKT,纯度可达70%左右,CBA检测刺激上清中细胞因子以IL-4为主,细胞过继输注至正常小鼠,观察小鼠的各项评分正常,小动物活体成像示踪细胞主要在肝脏和脾脏。3.iNKT细胞过继输注和α-Gal Cer注射均可显著改善RA小鼠体重增长缓慢、关节肿胀情况(P<0.05),减少足踝关节炎性细胞浸润;显著升高外周血、胸腺、脾脏中的iNKT细胞频率;脾脏中iNKT亚群、Th亚群及血清中细胞因子紊乱现象得到纠正。与control组相比,RA组脾脏在炎症初期T-bet蛋白表达显著升高(P<0.05);与RA组相比,细胞治疗组和α-GalCer组GATA-3蛋白表达显著升高(P<0.05),T-bet表达无显著性差异。结论1.GPI混合肽段诱导RA小鼠模型,在CD4+T细胞和iNKT细胞免疫病理方面更加接近RA病人。RA发病不仅与iNKT频率下降相关,而且与iNKT细胞亚群的变化具有紧密的联系。在RA炎症初期,恢复机体iNKT频率,调整iNKT亚群失衡,可能有利于调节RA小鼠体内Th亚群及细胞因子平衡,发挥治疗RA的作用。2.α-Galcer单次尾根部皮下注射后第8天,可以从小鼠胸腺中收获大量的iNKT2型细胞。过继输注到小鼠体内后可定居于脾脏和肝脏,且安全性得到验证。3.iNKT细胞输注,可以恢复RA小鼠体内iNKT频率,改变iNKT亚群,纠正Th细胞亚群失衡及下调炎性细胞因子水平,对于缓解RA具有积极的作用。