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转基因技术在农业领域的商业化应用加速了全球农业产出,彻底颠覆了当今世界农业格局,已逐步成为各国农业科技竞争的焦点。伴随转基因作物种植面积的激增与技术研发投入的日益扩大,关于转基因植物及其制品对人体健康和生态环境产生的潜在危害也引起了社会各界的广泛关注。为此,世界各国纷纷加强了对转基因产品的法制监管,同时对转基因检测提出了更为严格的要求。当前不同国家和地区的转基因标识制度、阈值范围和管理方式上存在较大差异,直接影响了转基因产品的进出口检验、国际贸易互认等问题。近年来,由于转基因农作物种植面积的激增,以及非法种植与基因横向漂移等问题,转基因检测需求日趋多样化、复杂化。然而,现有的以PCR为主的转基因检测技术效率低下、策略单一,存在多方面的技术局限性,很难满足农业转基因产业快速发展的需要。尤其是转基因盲检技术的缺失,严重限制了政府监管的能力,也制约了转基因技术的产业化发展。因此开发精准、高效、高通量的转基因盲检方法,对完善现有的转基因检测技术体系,促进农业转基因技术的健康发展,满足生物监管需求以及支撑转基因标识管理制度等方面意义重大。本研究以转基因大豆为研究对象,利用差减杂交策略富集外源转基因DNA片段,结合高通量测序技术与生物信息学分析手段,初步建立了准确、可靠的转基因盲检方法,在转基因盲检技术领域取得较大突破。本研究主要研究成果如下:1、构建外源基因与转化元件数据库利用文献搜索、数据库查询等检索方式,整合目前全部可用的转基因元件、外源基因、转化载体的DNA序列与检测方法,涵盖转基因数据库:ISAAA、EU-RLGMFF、CERA、GMDD、CropLife、GMOseek和NCBI等。建立转基因元件、外源基因的DNA序列数据库,为转基因盲检技术研究提供数据支撑。2、转基因盲检方法的初步建立利用抑制性差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH),以200 ng转基因大豆(DAS-81419)基因组DNA为例,利用30倍非转基因大豆基因组DNA与之杂交,通过基因组酶解、两轮差减杂交、适度巢式PCR扩增,实现了外源转基因DNA片段的成功富集。3、实现了多重转基因大豆的混样盲检针对8种市场占有率较高的转基因大豆品系DAS-81419、MON87701、DAS44406、MON87705、MON87769、MON89788、MON87708、GTS40-3-2,制备混样,以每种大豆100 ng基因组DNA为起始量,结合PCR-free高通量测序技术与生物信息学分析,在10X高通量测序数据下,成功实现了检出效率100%,初步建立了转基因盲检方法,相比内源基因Lectin,外源基因的富集效率可达40倍,检测灵敏度高,检测特异性良好。4、转基因盲检技术参数的优化针对初步建立的转基因盲检方法,在靶标DNA起始量、Driver DNA比例、四碱基内切酶的选择、基因组DNA酶解效率、富集效果、链酶亲和素磁珠捕获效率、完善生物信息学数据分析流程等方面进一步优化,有效的降低了非预期DNA片段的捕获率,提高了外源转基因片段的富集效率,从而降低高通量测序成本,提高数据分析效率,使假阳性和假阴性结果最小化。