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目的：探讨限制性片段差异显示聚合酶链反应(Restriction Fragment Differential Display—Polymerase Chained Reaction，RFDD-PCR)技术用于大范围初步筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关候选基因的可行性，确定进一步研究的相关候选基因，为下一步研究打好基础，同时为今后更深入的研究涎腺腺样囊性癌转移相关机制提供新线索。观察部分筛选出的候选基因在涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞株以及裸鼠移植瘤中的表达，初步探讨其在涎腺腺样囊性癌转移过程中可能的作用机制。方法：人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACC-M和低转移细胞株ACC-2由上海第九人民医院口外肿瘤实验室惠赠。其中ACC-M为ACC-2经体外和裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞克隆株，这两个细胞株遗传背景相同，只有转移能力相差较大。抽提符合要求的两细胞株总RNA，使用RFDD-PCR技术，通过平行操作，构建两个具有相同遗传背景，但转移能力相差较大的细胞株基因表达谱。应用高电压垂直电泳系统，以60W的恒定功率，在6％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，分离表达的基因片段，再配合高灵敏度的荧光成像系统Typhoon 9200，佐以图像分析软件ImageQuant TL，Image Tool，GeneTools，Fragment Analysis软件等对凝胶的图像进行分析，确定表达片段与差异表达片段数目。通过生物信息学方法对两个细胞株基因表达谱的差异进行分析，初步确定与涎腺腺样囊性癌转移相关的基因(或EST)，寻找有价值的候选片段。通过半定量RT-PCR用ACC-M、ACC-2细胞株对筛选出的候选基因的差异表达进行观察。用半定量RT-PCR、免疫组化方法检测ACC-M、ACC-2细胞株裸鼠移植瘤的MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表达情况，并比较其差异。结果：RFDD-PCR电泳图像显示，条带大小集中在50～1000bp之间，条带间界线清晰，各条带间分离效果好。两个细胞株共获得有意义的条带5420条，其中ACC-M细胞株2619条，ACC-2细胞株2801条。以GeneTools软件对条带进行分析，有差异的片段为1734条，差异条带为总条带数的32％。与ACC-2细胞株的表达相比，ACC-M细胞株表达信号增强的基因片段433条，表达减弱的基因片段562条；ACC-M细胞株出现的基因片段416条，消失的基因片段323条；达到了构建表达谱的要求。在将图像数据转换为生物信息学数据的过程中，比较了各种拟合曲线后，发现以POWER方程拟合度最佳，相关系数(R~2)均超过0.983。通过生物信息学分析，并对发现的5420个条带的基因进行初步对比分析发现，涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞株基因表达涉及：跨膜糖蛋白、离子通道蛋白、生长因子及其受体、细胞因子、信号传递分子、细胞周期蛋白、代谢酶、与增殖和凋亡相关的基因，等等。进一步差异分析发现，基质金属蛋白酶家族中MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-15、MMP-20、MMP-28在ACC-M中的表达高于ACC-2；MMP-14、MMP-24在ACC-M中的表达低于ACC-2；MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在ACC-M和ACC-2之间的表达接近。钙粘素家族中CDH11、CDH12在ACC-M表达高于ACC-2；CDH2、CDH4、CDH5、CDH10、CDH19在ACC-M表达低于ACC-2；CDH1、CDH9、CDH13、CDH20在两细胞株中无差异：CDH3、CDH6、CDH8在ACC-M不表达而在ACC-2有表达。整合素ITGB4、ITGB7在ACC-M表达低于ACC-2；ITGB2在两细胞株中无差异ITGB3、ITGB5、ITGB8在ACC-M不表达而在ACC-2有表达。KAI1在ACC-M明显低于在ACC-2的表达。半定量RT-PCR发现，在表达谱生物信息学分析发现的12个基质金属蛋白酶基因中，MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-15在ACC-M细胞株的表达明显高于ACC-2，而MMP-14、MMP-24的表达ACC-M又明显低于ACC-2。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在两细胞株中的差异无统计学意义。MMP-20、MMP-28没有出现预期的条带。半定量RT-PCR和免疫组化结果均显示，MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1在ACC-M裸鼠移植瘤中的表达高于ACC-2裸鼠移植瘤的表达，而TIMP-2在两细胞株裸鼠移植瘤表达之间的差异无统计学意义。结论：根据本研究所得的ACC-M、ACC-2两细胞株64个“表达窗”所显示的条带总数，以及通过生物信息学方法比较所筛选出的候选基因数目和种类，结合本课题组的其它实验，说明RFDD-PCR具有高灵敏性、高覆盖率和高重现性，可用于大范围疾病相关基因的初步筛选。且不受以往研究结果的限制，有利于寻找新的疾病研究切入点。本课题从ACC-M、ACC-2两细胞株共获得有意义条带5420条，同时观察到两细胞株的差异条带达1734条，占总条带数的32％。经生物信息学分析，差异条带包括跨膜糖蛋白、离子通道蛋白、生长因子及其受体、细胞因子、信号传递分子、细胞周期蛋白、代谢酶、与增殖和凋亡相关的基因，等多种基因。结果提示，仅转移能力增强的行为学变化就可能涉及肿瘤细胞功能基因组的变化，寻找诊治肿瘤转移的靶点将会遇到极大的挑战。本课题结合涎腺腺样囊性癌易于浸润神经纤维的特点，筛选出了若干未见报道或报道不全的与涎腺腺样囊性癌转移相关的基因(家族成员)，并对其中的MMPs、TIMPs基因家族与涎腺腺样囊性癌转移的关系进行了更深入的探讨，为进一步了解涎腺腺样囊性癌的转移机制及临床诊疗提供新线索。本研究发现，ACC-M的高转移能力可能与MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、MMP-15和MMP-24相关。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在两细胞株中无差异，可能是不同的肿瘤细胞周围基质存在种类和量的不同，说明不同肿瘤细胞的转移能力可能与不同的MMPs家族基因相关。MMP-19、MMP-20、MMP-8与涎腺腺样囊性癌的转移是否相关还有待进一步证实。同时我们发现，ACC-M与ACC-2两细胞株在体内和体外可能具有相同的表型，且这两个细胞株遗传背景相同，只有转移能力相差较大，在基因水平上表达有明显的差异，说明这些差异可能与转移有关。观察到ACC-M移植瘤细胞TIMP-1表达高于ACC-2移植瘤细胞，支持TIMP-1可能具有生长因子样作用的学说，它可能促进肿瘤细胞的生长。TIMP-2在两个细胞株裸鼠移植瘤组织中的表达之间无差异，与本文作者以前的体外实验结果一致。结合以往的研究结果，认为TIMPs家族成员可能在肿瘤的生长和转移过程中起多种作用，MMPs家族成员与它们之间的关系和作用还值得深入研究。