论文部分内容阅读
妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease, GTD）是一组罕见的滋养叶组织疾病，可以看作是起源于浸润母体（胞衣）组织受孕的同种异体移植物，具有独特的形态学和临床生物学行为，主要包括葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌和胎盘部位滋养细胞肿瘤。其中，绒毛膜癌（简称绒癌）是唯一由细胞滋养层和合体滋养层共同组成的高度恶性肿瘤。滋养细胞的异常增殖和高度侵袭可以导致绒癌的发生，而基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases, MMPs）及其抑制剂（tissue inhibitors ofmetalloproteases, TIMPs）作为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解的关键因子参与了肿瘤的侵袭和转移。白介素-12（interleukin-12, IL-12）是由巨噬细胞及单核细胞等抗原提呈细胞产生的细胞因子，主要介导T细胞和自然杀伤细胞的免疫调节过程，同时对肿瘤和感染性疾病具有治疗作用。近年来，IL-12由于其免疫调节功能及抗肿瘤活性成为靶向治疗的热点，然而IL-12在绒癌中的研究报道罕见，因此，我们观察IL-12在不同剂量及作用时间下对绒癌JEG-3细胞的增殖和周期时相的影响，同时检测MMP-9及TIMP-1的表达情况，将会为绒癌的细胞因子疗法奠定实验基础，同时为绒癌的临床早期治疗开拓新的思路。第一部分外源性IL-12对绒癌JEG-3细胞体外增殖的影响及意义目的：以外源性IL-12预处理绒癌JEG-3细胞，采用MTT比色法检测JEG-3细胞的增殖活力，探讨重组人IL-12对绒癌细胞活性的影响。方法：本文的研究对象为永生化的绒癌JEG-3细胞系。取指数生长期的JEG-3细胞按初始浓度为3×104/mL接种于96孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养48小时（hour, h）后换成无血清培养基使其继续饥饿同步化24h；然后分别给予0μg/L，5μg/L，10μg/L，25μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L的IL-12对JEG-3细胞进行外源性干预，48h终止培养并收获细胞；同时，选择5μg/L的IL-12预处理JEG-3细胞，分别培养0h、24h、36h、48h、72h，终止培养。每组设5个平行孔。采用MTT比色法检测各组细胞的增殖活力。结果：1与空白对照组比较，以不同剂量IL-12处理JEG-3细胞后，细胞增殖率显著降低（P<0.05）；随着作用浓度的升高，IL-12对JEG-3细胞增殖的抑制作用呈下降趋势，5μg/L的IL-12对JEG-3细胞抑制作用最强。2随着IL-12作用时间的延长，细胞的增殖活力明显降低（P<0.05）。结论：外源性IL-12能够抑制绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖，具有良好的浓度和时间依赖效应。第二部分外源性IL-12对绒癌JEG-3细胞侵袭相关分子MMP-9、TIMP-1mRNA和蛋白表达的影响目的：探讨外源性IL-12对绒癌JEG-3细胞侵袭相关分子MMP-9和TIMP-1的表达情况。方法：以3×104/mL细胞浓度将JEG-3细胞接种到6孔板，培育48小时后饥饿同步化24小时，加入不同浓度的人重组IL-12，即终浓度分别为0μg/L（对照组），5μg/L，10μg/L，25μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L，共温育48h后终止培养；同时观察IL-12的不同处理时间对细胞的影响，用5μg/L IL-12处理JEG-3细胞，分别培育0h、24h、36h、48h和72h后终止培养，每组设5个平行孔。采用逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）和蛋白印迹法（WesternBlotting）检测各组MMP-9、TIMP-1mRNA及蛋白表达情况。结果：1与对照组比较，IL-12各浓度处理组JEG-3细胞的MMP-9mRNA和蛋白的表达量均下降（P<0.05），然而随着浓度的升高，IL-12对MMP-9的下调能力减弱（P<0.05）；TIMP-1mRNA与蛋白的表达则与MMP-9呈现相反趋势（P<0.05）。2随着IL-12作用时间的延长，JEG-3细胞MMP-9mRNA及蛋白的表达均呈现下降趋势（P<0.05），TIMP-1的表达呈现上升趋势（P<0.05）。结论：外源性IL-12可能通过下调MMP-9及上调TIMP-1的表达水平从而抑制绒癌JEG-3细胞的侵袭能力。第三部分外源性IL-12对绒癌JEG-3细胞周期时相的影响目的：观察外源性IL-12对绒癌JEG-3细胞周期的影响。方法：以3×104/mL的细胞浓度将JEG-3细胞接种到培养瓶，细胞贴壁48h，饥饿同步化24h后，加入不同浓度的重组人IL-12，即终浓度分别为0μg/L（对照组），5μg/L，10μg/L，25μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L，各剂量组均温育48h和72h后终止培养。每组设5次独立实验。采用流式细胞术（Flow Cytometry）检测JEG-3细胞的周期时相变化。结果：与对照组比较，IL-12各处理组在48h和72h均观察到细胞在G2期比例下降，细胞周期发生阻滞（P<0.05）。48h后，细胞周期主要阻滞在S期（P<0.05），而72h后，S和G1期均发生阻滞（P<0.05）。结论：IL-12可改变绒癌JEG-3细胞周期时相，使JEG-3细胞发生阻滞，从而影响细胞的增殖和侵袭。