研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC;简称肝癌),在全世界范围内发病率排在第六位,每年全世界的发病是62.6万,我国每年死于肝癌约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。相对于高死亡率,早期肝癌的发现比例却非常低。近年来,虽然针对肝癌的治疗手段不断更新(包括手术切除、肝移植术、放射治疗、介入治疗、微创消融治疗等),但肝癌治疗的总体疗效并无明显提高,复发和转移仍然是影响肝癌预后的最主要因素。因此,加强对肝癌侵袭转移分子机制的研究,挖掘有意义的肝癌转移分子标志物,寻找新的防治靶点,是目前肝癌研究热点之一。HMGB1属于HMG (high mobility group, HMG)的亚家族成员,于20世纪70年代在小牛胸腺中发现,是一种含量丰富的核蛋白,分子质量约30kD,存在于所有真核生物中。人的HMGB1基因定位于染色体13q12,包含5个外显子和4个内含子,编码含215个氨基酸的蛋白。HMGB1高度保守,人与啮齿类动物氨基酸序列同源性高达99%以上,而小鼠与大鼠氨基酸序列完全一致。HMGB1因其细胞定位不同而发挥不同的功能和生物学效应。目前研究认为,除作为“晚期炎症介质”启动炎症反应外,分泌到细胞外的HMGB1还可能与肿瘤的演进和转移密切相关。在增殖的细胞组织及分化活跃的细胞中,HMGB1基因表达有轻度的升高,而在乳腺癌、黑色素瘤、胃肠间质细胞瘤、胰腺癌等肿瘤组织中,HMGB1的表达水平明显高于其相对应的正常组织,且与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移能力密切相关。因此,认为HMGB1也参与了恶性肿瘤的发生、发展、演进过程。Brezniceanu等在人原发性乳腺癌细胞中发现了HMGB1蛋白的高水平表达,HMGB1可以阻断Bcl-2家族促凋亡基因Bak诱导的细胞凋亡,其高水平表达可促进肿瘤的生长。Wu等研究发现,HMGB1过表达与鼻咽癌的TNM分期和临床分期密切相关,表达水平越高的患者,总体生存率和无瘤生存率越低；抑制HMGB1表达,鼻咽癌细胞的侵袭性减小。Volp等[15]在结肠癌的研究中发现HMGB1及其受体RAGE共表达增强了结肠癌细胞的侵袭和转移能力。应用HMGB1反义寡核苷酸能显著抑制结肠肿瘤细胞生长、迁移和侵袭,同时下调细胞信号通路上相关分子的表达[16]。在口腔鳞状上皮细胞癌中,HMGB1可通过诱导其黑色素瘤抑制蛋白(MIA)的表达而有促进其淋巴结转移及新生淋巴管生成的作用。上述研究表明,HMGB1是多种肿瘤的促癌基因和促进转移基因。本研究拟应用48例癌组织和癌旁组织组成的96点组织芯片,采用免疫组化方法检测和观察人体恶性肿瘤组织和正常组织HMGB1表达情况；应用Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫细胞化学检测7种人肝癌细胞株和1种人正常肝细胞株HMGB1基因／蛋白的表达：收集208例带有5年完整随访资料的肝癌组织,应用免疫组化检测分析HMGB1蛋白在肝癌中的表达及其与各临床病理参数之间的关系,同时结合临床随访资料回顾性分析HMGB1蛋白表达与肝癌患者生存期的关系；利用基因沉默及过表达技术初步研究HMGB1基因在肝癌增殖、迁移及侵袭中的作用,探讨HMGB1在肝癌发生发展中的作用；为肝癌患者的诊断、预后评价、综合治疗方案设计提供的理论依据。方法1、组织芯片技术分析HMGB1蛋白在人体正常组织和恶性肿瘤组织中的表达购买西安爱丽娜生物科技公司的组织芯片,由48例癌组织和48例癌旁组织组成的96点组织芯片,包括胃、淋巴结、结肠、直肠、肝、肺、肾、食管、乳腺、宫颈、卵巢、膀胱、皮肤、脑、前列腺、胰腺等16种器官的癌及对应的癌旁正常组织。免疫组化方法检测HMGB1蛋白在人体正常组织和常见恶性肿瘤组织的分布和表达。2、HMGB1基因/蛋白在人正常肝细胞和肝癌细胞中的表达Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫细胞化学等方法检测HepG2, HCCLM6(简称M6), Huh7, MHCC97H(简称97H), MHCC97L(简称97L), HCCLM3(简称M3), BEL-7404等7种肝癌细胞株和人正常肝细胞株L02的HMGB1基因/蛋白的表达情况。3、HMGB1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义应用免疫组化EnVisionTM二步法检测HMGB1蛋白在208例肝癌组织中的表达；应用SPSS13.0软件进行统计学处理,采用X2检验分析HMGB1蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系；采用Kaplan-Meier法回顾性分析HMGB1蛋白表达与肝癌患者生存期的关系；以COX回归对各项指标单因素或多变量联合与生存期的关系进行统计学分析。4、HMGB1基因沉默对肝癌细胞生物学特性的影响利用购买自上海吉玛公司的含有HMGB1基因干扰片段的siRNA,采用瞬时转染法转染高表达HMGB1的97H肝癌细胞,用含空载体的病毒做对照。荧光定量PCR和Western blot检测HMGB1干扰效率。利用cck-8检测HMGB1基因沉默后对肝癌细胞体外增殖的影响；应用未铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因沉默后对肝癌细胞体外迁移能力的影响；应用铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因沉默后对肝癌细胞体外侵袭能力的影响。5、HMGB1基因过表达对肝癌细胞生物学特性的影响应用购买自上海吉凯生物公司的含有HMGB1基因片段的GV142载体转染低表达HMGB1基因的M3肝癌细胞,用含空载体的病毒做对照。荧光定量PCR和Western blot检测HMGB1干扰效率。利用cck-8检测HMGB1基因过表达后对肝癌细胞体外增殖的影响；应用未铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因过表达后对肝癌细胞迁移能力的影响；应用铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因过表达后对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果1、组织芯片技术分析HMGB1蛋白在人体正常组织和恶性肿瘤组织中的表达恶性肿瘤组织中HMGB1阳性率达89.6%,正常组织阳性率77.1%,癌组织强阳性率54.1%,癌旁正常组织强阳性率6.5%。恶性肿瘤组织与癌旁正常组织HMGB1表达差异性具有统计学意义(P<0.01)。癌组织中强表达例数占大多数,而正常组织多为弱至中等强度表达。2、HMGB1基因/蛋白在肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达采用实时荧光定量PCR法检测7种人肝癌细胞株和1种人正常肝细胞株中HMGB1基因的表达情况。在HMGB1在6种肝癌细胞：HepG2, M6, Huh7,97H,97L, BEL-7404表达水平均高于正常肝细胞中的表达水平,而肝癌细胞M3表达量低于正常肝细胞,差异具有统计学意义；Western blot检测HMGB1蛋白与实时荧光定量PCR检测的HMGB1基因RNA表达趋势基本一致；免疫细胞化学检测结果显示,HMGB1蛋白在正常肝细胞株中阴性～弱表达,而在肝癌细胞株中均呈强阳性表达。3、HMGB1蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义免疫组化检测结果显示：HMGB1蛋白在208例肝癌组织中的高表达为134例(64.4%),低表达为74例(35.6%)。HMGB1在肝癌的细胞核与细胞质中都有表达,但在肝的正常组织呈阴性～低表达,在肝硬化组织呈低～中度表达；HMGB1蛋白表达水平除了与AFP(P=0.03<0.05)明显相关；HMGB1蛋白表达和各临床病理参数与肝癌患者生存期的单因素分析,结果显示HMGB1蛋白高表达、性别、肿瘤大小、转移、复发和血清AFP值是影响肝癌患者生存时间的因素(P值分别为：0.002、0.002、0.021、0.001、0.003、0.001);HMGB1蛋白表达、性别、肿瘤大小、转移、复发、血清AFP值与肝癌患者生存期的多因素分析,结果发现HMGB1蛋白表达、性别、转移、复发和血清AFP值分别是影响肝癌生存预后的独立因素(P值分别为：0.003、0.002、0.016、0.013、0.001)。4、HMGB1基因表达沉默对肝癌细胞生物学特性的影响①应用含有HMGB1干扰片段的siRNA瞬时转染外源性表达HMGB1较高的肝癌细胞M6。利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测各干扰片段HMGB1的表达情况,筛选干扰效率最高的片段为下一步实验的研究对象(命名为M6/S2细胞)。②应用cck-8检测HMGB1基因表达沉默后细胞的体外增殖情况,与M6细胞和M6/Mock细胞相比,M6/S2细胞的增殖速度明显减慢。综合结果表明HMGB1基因沉默后,肿瘤细胞体外生长被抑制。③应用未铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因表达沉默后细胞迁移能力的改变,结果显示：与M6细胞和M6/Mock细胞相比,M6/S2细胞的迁移能力明显降低(P<0.05),说明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌细胞的迁移能力。④应用铺了基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因表达沉默后细胞侵能力的改变,结果显示：与M6细胞和M6/Mock细胞相比,M6/HMGB1细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05),说明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌细胞的侵袭能力。5、HMGB1基因表达增强对肝癌细胞生物学特性的影响①应用含有HMGB1基因片段的GV142载体瞬时转染外源性表达HMGB1较低的肝癌细胞M3,利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染了HMGB1的M3细胞(命名为M3/HMGB1+)表达情况,转染空载体GV142为对照实验的研究对象(命名为M3/Mock细胞)。②应用cck-8检测HMGB1基因过表达后细胞的体外增殖情况,与M3细胞和M3/Mock细胞相比,M3/HMGB1+细胞的增殖速度明显增强。综合分析HMGB1基因过表达后,能促进细胞的体外增殖。③应用未铺基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因过表达后细胞迁移能力的改变,结果显示：与M3细胞和M3/Mock细胞相比,M3/HMGB1+细胞的迁移能力明显增强(P<0.05),说明HMGB1基因的过表达增强了肝癌细胞的迁移能力。④应用铺了基质胶的Transwell小室检测HMGB1基因过表达后细胞侵袭能力的改变,结果显示：与M3细胞和M3/Mock细胞相比,M3/HMGB1+细胞的侵袭能力明显增强(P<0.05),说明HMGB1基因的过表达增强了肝癌细胞的侵袭能力。结论1. HMGB1在多种恶性肿瘤组织强阳性表达,而在正常组织呈现弱至中等强度表达,我们认为其可能成为鉴别正常组织与癌组织的的生物学标志之一。2. HMGB1基因/蛋白在人肝癌细胞中的表达明显强于正常人肝细胞,表明HMGB1可能是导致肿瘤发生发展中重要的分子之一。3. HMGB1蛋白在208例肝癌标本中呈高表达,结合临床随访资料分析表明HMGB1与患者的AFP值密切相关,HMGB1蛋白高表达者的生存期明显短于低表达者,提示HMGB1可作为肝癌预后判断的重要指标；4. HMGB1蛋白在肝癌组织中高表达,在肝硬化组织中弱表达,而在正常肝组织中几乎不表达,提示HMGB1可作为临床肝癌检测的重要肿瘤标志物；统计分析发现HMGB1蛋白表达、性别、转移、复发和血清AFP值分别是影响肝癌生存预后的独立因素。5. HMGB1基因与肝癌发生发展密切相关,是促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的重要基因之一。本研究的创新之处1.发现HMGB1与肝癌的预后相关,为开展肝癌基因靶向治疗奠定了理论基础。2.下调高表达HMGB1基因的肝癌细胞株M6与上调低表达HMGB1基因的肝癌细胞株M3,两方面验证了HMGB1基因对肝癌细胞的影响,为研究HMGB1基因的功能提供了有价值的研究工具。