目的：肾小管间质纤维化(renal tubulointerstitial fibrosis，RTIF)是糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN)的主要病理特征，在RTIF进程中肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)发挥着关键作用，但此过程涉及多种分子介质和细胞事件的参与，影响因素众多，且相互作用复杂，以致至今对其分子机制尚未完全阐明。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公认致纤维化作用最强的细胞因子，主要通过TGF-β1/Smad细胞信号通路诱导和调节肾小管EMT及RTIF的全过程。核转录共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)是该信号传导途径的重要负调控因子，对TGF-β1的生物学效应起负调控作用。本课题组前期研究发现，在DN发病过程中SnoN蛋白的减少放大了TGF-β1的致纤维化效应，但SnoN蛋白表达降低在DN肾纤维化发病中的确切作用和机制尚需要进一步的研究。本实验旨在以SnoN为研究靶点，以糖尿病（diabetes mellitus，DM）大鼠模型和高糖处理的肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTECs）为研究对象，分别从蛋白水平、转录水平、外源性药物干预等三个方面，利用siRNA技术敲低RTECs中E3泛素连接酶Arkadia表达、慢病毒稳定转染体系使RTECs过表达SnoN、体内和体外OM干预等方法，结合肾小管EMT和纤维化等相关指标的检测。进一步明确SnoN表达变化与肾小管EMT和RTIF的关系，探讨上调肾小管SnoN表达在改善DN肾间质纤维化发病中的作用及其可能机制，为有效防治DN提供理论和实验依据。　　方法：1.（1）动物实验：雄性SD大鼠随机分为正常对照（NC）组和DM组。以尾静脉注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）复制DM大鼠模型，48小时（h）后测空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性者判断造模成功。NC组大鼠尾静脉注射STZ溶媒。各组大鼠均予标准饲料喂养，自由饮水，饲养至16周（W）处死。生化法测血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿蛋白（UP），记录24h尿量计算24h尿蛋白量（24hUP）；HE（hematoxylin and eosin）和Masson染色后显微镜下观察肾组织病理变化；免疫组化法检测E-钙粘素（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）在肾小管的分布和表达；Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）分别检测TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表达。（2）细胞实验：体外培养的正常大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E)随机分组，①正常糖（NG）组：2％ FBS+ DMEM+5.5mmol/L Glucose，②高糖(HG)组：2% FBS+ DMEM+25mmol/L Glucose，各组分别设2h、12h、24h、48h和72h五个培养时间点；应用免疫荧光染色（Immunofluorescence staining，IF）检测各组细胞中E-cadherin、α-SMA表达变化，Western blot和qRT-PCR分别检测各组细胞中TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表达。2.采用siRNA干扰技术敲低正常人近端肾小管上皮细胞(HK-2)中Arkadia的表达，高糖条件下培养48h后，qRT-PCR法检测各组细胞SnoN和Arkadia的mRNA表达；Western blot法检测各组细胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表达；酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测培养液中的FN蛋白量。3.利用慢病毒稳定转染体系使HK-2细胞中SnoN过表达，高糖条件下培养48h后，Western blot法检测各组细胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表达；qRT-PCR法检测各组细胞SnoN和Arkadia的mRNA表达；ELISA法检测培养液中的FN蛋白量。4. OM干预处理，（1）动物实验：雄性SD大鼠随机分为NC组、DM组和OM治疗组。STZ复制DM大鼠模型，48h后测空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性者判断造模成功。NC组大鼠尾静脉注射STZ溶媒，OM治疗组自DM大鼠造模成功次日起，予以75mg//kg/d OM灌胃处理。各组大鼠均给予标准饲料喂养，自由饮水，大鼠饲养至16 W处死。生化法测BG、Scr、UP，记录24 h尿量计算24hUP；HE和Masson染色后显微镜下观察肾组织病理变化；免疫组化法检测E-cadherin、α-SMA、FN在肾小管的分布和表达；Western blot和qRT-PCR分别检测TGF-β1、SnoN、Smad7、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表达。（2）细胞实验一：NRK52E细胞分组①NG组，②HG组，③HG+不同浓度OM（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50mg/ml）组，培养48h。利用免疫荧光染色-激光共聚焦显微镜（IF-LSCM）检测E-cadherin和α-SMA的表达强度、Western blot、qRT-PCR方法检测SnoN、Smad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表达。细胞实验二：①NG组，②HG组，③HG+0.50mg/ml OM动态观察(HM)组，分别设2h、12h、24h、48h和72h五个培养时间点进行动态观察，利用Western blot、qRT-PCR方法检测SnoN、Smad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN蛋白和mRNA表达。　　结果：1.（1）动物实验：与NC组相比，DM组大鼠BG、Scr、24hUP显著增高，伴明显肾纤维化病变，E-cadherin蛋白表达显著降低，α-SMA、FN蛋白表达显著增高；TGF-β1、Arkadia蛋白和mRNA表达显著增高；SnoN蛋白水平显著降低，而mRNA水平显著增高。（2）细胞实验：与NG组相比，HG组NRK52E细胞随高糖刺激时间延长，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表达进行性增高，E-cadherin mRNA和蛋白表达进行性降低，呈时间依赖性；SnoN蛋白表达进行性降低，而SnoN mRNA表达进行性增高。2. siRNA敲低正常人近端肾小管细胞（HK-2）的Arkadia后高糖处理48h，与空白细胞组相比，Arkadia mRNA和蛋白水平显著降低，SnoN和E-cadherin表达显著增高，α-SMA和FN表达显著降低，TGF-β1表达无显著差异。3.过表达SnoN的HK-2细胞高糖处理48h后，与空白细胞组相比，SnoN mRNA和蛋白水平均显著增高，E-cadherin表达显著增高，α-SMA和FN蛋白显著降低，Arkadia和TGF-β1表达均无显著差异。4. OM干预效果（1）动物实验：与DM组相比，OM治疗组BG无明显差异，Scr、24hUP明显降低，纤维化病变有所改善，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN表达明显降低，SnoN、Smad7、E-cadherin表达明显增高。（2）细胞实验一：①激光共聚焦显微镜观察发现，作用48h，与NG组相比，HG组E-cadherin表达明显减弱，α-SMA表达明显增强；与HG组相比，HG+OM不同浓度组随OM剂量下降，E-cadherin表达逐渐减弱，α-SMA表达逐渐增强；与HG组各相应时间点NRE52E细胞相比，HG+0.50mg/ml OM组TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN mRNA和蛋白显著降低，Smad7和SnoN蛋白显著增高，E-cadherin mRNA和蛋白显著增高，而Smad7和SnoN mRNA水平无明显差异。②Western blot、qRT-PCR结果显示，与HG组相比，HG+OM不同浓度组随OM剂量增加，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表达均逐渐降低，E-cadherin蛋白和mRNA表达逐渐增高，SnoN和Smad7蛋白表达逐渐增高，呈剂量依赖性，而SnoN和Smad7 mRNA表达无明显差异。　　结论：1.高糖通过促进肾小管上皮细胞中Arkadia表达增高，增强对SnoN蛋白泛素化降解水平而下调SnoN蛋白表达，即肾小管上皮细胞中SnoN的表达受Arkadia调控；2.敲低肾小管上皮细胞中Arkadia mRNA表达，使SnoN蛋白表达上调，对高糖诱导的肾小管EMT有抑制作用；3.过表达肾小管上皮细胞中SnoN可抑制高糖诱导的肾小管EMT；4. OM通过抑制Arkadia表达而上调SnoN蛋白表达，增强对TGF-β1/Smad细胞信号传递通路的负调控作用，抑制高糖诱导的肾小管EMT过程，改善DN肾间质纤维化。