背景：哮喘是由基因和环境因素共同导致的常见呼吸道疾病，其发病机制、治疗等诸多环节仍尚未完全清楚，因此探讨哮喘发病机制、寻找新防治靶点仍然是研究的重要内容。肺组织高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1，HMGB1)是一种高度保守的核蛋白，可作为一种免疫调节因子和炎性因子参与气道炎症；Toll样受体4（Toll like receptors4，TLR4）是一种重要的免疫识别受体，连接天然免疫和获得性免疫，在启动和调节气道炎症过程中发挥重要作用。HMGB1可与 TLR4结合并相互作用，通过激活核转录因子(Nuclear factor-kappa B，NF-KB)，引起下游的炎症介质释放。维生素D既参与钙磷代谢调节，还具有免疫调节作用，主要通过影响单核细胞、树突状细胞(Dendritic cell，DC)、淋巴细胞等免疫细胞发挥广谱的抗炎作用，并通过影响多种细胞的生长和分化参与气道结构的调节。目前，国内外关于维生素 D与哮喘的研究有一些报道，但具体作用机制仍不明确。关于HMGB1、TLR-4在哮喘动物肺组织的表达及维生素D的干预研究较少,而哮喘动物外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达研究更少，HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及维生素D的调控研究国内外未见报道。本课题通过建立哮喘小鼠模型，观察肺组织病理学改变，BALF中细胞计数和分类变化，外周血和BALF中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量变化；肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA和蛋白的表达变化，进一步探讨哮喘的发病机制。维生素D是一种生物制剂，副作用小，价格便宜，使用依从性好，与类固醇激素作用相似；本实验应用该药进行干预性试验，观察其对HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路及气道炎症和气道重塑的影响，从新的角度诠释其在哮喘防治中的作用，进一步挖掘老药的新用途，为临床研究和应用提供基础实验依据。本研究分为两个部分：　　第一部分：不同剂量维生素D对哮喘小鼠肺组织HMGB1、TLR4表达的影响。　　目的：通过建立哮喘小鼠气道重塑模型，观察HMGB1及TLR4在肺组织的表达,以及不同剂量维生素D对哮喘气道重塑及HMGB1和TLR4表达的影响。　　方法：50只BALB/c小鼠随机分为5组：对照组、哮喘组、1,25-(OH)2D3低剂量组、1,25-(OH）2D3中剂量组和1,25-(OH)2D3高剂量组，每组10只。采用卵清蛋白(OVA)致敏建立哮喘模型，对照组以生理盐水代替，然后给予1,25-(OH)2D3低、中、高三种剂量干预，采用苏木精-伊红(HE)染色在光学显微镜高倍镜视野（10×40）下观察小鼠肺组织病理学变化，支气管壁厚度的测定采用计算机病理图像分析系统进行。采用免疫组化法观察肺组织HMGB1及TLR4表达的变化，应用计算机病理图像分析系统测定蛋白的表达量。采用RT-PCR法检测 HMGB1及TLR4mRNA表达变化，基因的相对表达量按灰度值比值公式计算。　　结果：⑴哮喘组小鼠出现流涕，打喷嚏，呼吸急促，咳嗽，点头呼吸等哮喘样表现，重者出现紫绀，四肢瘫软；提示模型制作成功。⑵哮喘组小鼠气道损伤明显、可见大量炎性细胞浸润，上皮细胞紊乱、脱落，气道壁明显增厚，管腔狭窄；1,25-(OH)2D3低、中剂量组支气管壁结构较哮喘组完整光滑，管腔狭窄和炎性细胞浸润较哮喘组减轻；但高剂量组较哮喘组气道结构破坏加重。⑶哮喘组小鼠气道壁厚度较对照组明显增加，1,25-(OH)2D3低、中剂量组气道壁厚度较哮喘组明显减轻(均 P＜0.05)，但高剂量组小鼠气道壁厚度却较哮喘组明显增加(P＜0.05)。⑷免疫组化结果显示：对照组小鼠HMGB1和TLR4蛋白表达较弱；哮喘组小鼠HMGB1和TLR4表达较强，哮喘组较对照组HMGB1和TLR4表达明显增高(均P＜0.05)；1,25-(OH)2D3低、中剂量组HMGB1及TLR4表达明显低于哮喘组(均P＜0.05)，而高剂量组则明显高于哮喘组(均P＜0.05)。⑸RT-PCR结果显示:哮喘组HMGB1mRNA和TLR4 mRNA表达较对照组明显增高；1,25-(OH)2D3低、中剂量组HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA相对表达量均较哮喘组明显降低(均P＜0.05)，而高剂量组则明显高于哮喘组(均P＜0.05)。　　结论：①在OVA致敏的哮喘气道重塑模型中，HMGB1和TLR4表达明显增高；②适量1,25-(OH)2D3可降低肺组织HMGB1和TLR4表达，减轻气道重塑；过量则可能增加HMGB1和TLR4表达，加重气道重塑；③适量1,25-(OH)2D3可能通过抑制HMGB1/TLR4信号通路,阻止下游的炎症因子释放，改善哮喘气道重塑。　　第二部分：哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-ΚB信号通路及维生素D的作用。　　目的：观察不同时间点哮喘小鼠病理学变化，BALF中细胞总数和分类变化，外周血和BALF中HMGB1、TLR4、IL-4和IFN-γ含量变化，肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA和蛋白表达变化，以及维生素D的干预作用。　　方法：48只BALB/c小鼠随机分为3组，对照组、哮喘组和1,25-(OH)2D3干预组，每组小鼠为16只。雾化激发处理后，每组按两个观察时间点（1周和2周）进行标本处理，每个时间点取小鼠标本8只。建立哮喘激发1周和2周动物模型，同期采用中等剂量的1,25-(OH)2D3进行干预试验。各组按不同时间点取小鼠右肺中叶进行HE和免疫组化染色，观察小鼠病理学变化，测定其气道壁厚度，观察HMGB1、TLR4和NF-KB在肺组织的表达部位。同时收集BALF和外周血，BALF进行细胞学检测；采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF和外周血中HMGB1、TLR-4、IL-4和IFN-γ含量；采用实时定量荧光PCR（Real-time PCR)和Western blot(蛋白质印迹法）分别从mRNA和蛋白质水平检测HMGB1、TLR4和NF-KB表达变化，基因的相对表达量按2-△△Ct计算，蛋白的相对表达量根据相对灰度值公式计算。　　结果：⑴哮喘组1,2周气道壁厚度和气道损伤较对照组1,2周明显增加（均P<0.05）；干预组1,2周较哮喘组1,2周气道壁厚度和气道结构破坏明显减轻（均P<0.05）。⑵哮喘组1,2周与对照组1,2周比较，BALF中白细胞总数，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显升高，单核/巨噬细胞比例明显下降（均P<0.05）；干预组1,2周与哮喘组1,2周比较，BALF中白细胞总数，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞比例明显下降，单核/巨噬细胞比例明显上升（均P<0.05）。⑶哮喘组1,2周BALF中HMGB1、TLR4和IL-4含量均明显高于对照组1,2周，IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周（均P<0.05）；干预组1,2周BALF中TLR4和IL-4均明显低于哮喘组1,2周，IFN-γ含量均明显高于哮喘组1，2周（均P<0.05）；第1周时干预组BALF中HMGB1较哮喘组无变化（P>0.05），但第2周时干预组明显低于哮喘组（P<0.05）。⑷哮喘组1,2周外周血中HMGB1和IL-4含量均明显高于对照组1,2周，IFN-γ含量均明显低于对照组1,2周，干预组1,2周外周血中HMGB1和IL-4均明显低于哮喘组1,2周，IFN-γ含量均明显高于哮喘组1,2周（均P<0.05）；第1周时哮喘组外周血中TLR4含量与对照组比较无差异（P>0.05），但第2周时明显高于对照组（P<0.05）；第1周时干预组外周血中TLR4含量与哮喘组比较无差异（P>0.05），但第2周时明显低于哮喘组（P<0.05）。⑸哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4、和NF-KB mRNA表达量均明显高于对照组1,2周；干预组1,2周肺组织中TLR4和NF-KB mRNA表达量均明显低于哮喘组1,2周（P均<0.05）。第1周时干预组HMGB1 mRNA与哮喘组比较无明显差异（P>0.05），但在第2周时干预组则明显下降（P<0.05）。⑹哮喘组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显高于对照组1,2周；干预组1,2周肺组织中HMGB1、TLR4和NF-KB蛋白表达量均明显低于哮喘组1,2周（均P<0.05）。⑺小鼠气道壁厚度与肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB mRNA的表达量均呈正相关性（r分别为0.802，0.895，0.834；均P<0.05）；肺组织HMGB1、TLR4和NF-KB的mRNA表达量及蛋白表达量间均呈正相关（r分别为0.871，0.841，0.823；均P<0.05）。⑻外周血中IL-4、IFN-γ与BALF中IL-4和IFN-γ浓度均呈正相关（r分别为0.600，0.743；均P<0.05）；外周血和BALF中IL-4浓度与HMGB1、TLR4浓度间均呈正相关性（r1分别为0.696，0.331，r2分别为0.695，0.648；均P<0.05）。⑼BALF中HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1mRNA、TLR4mRNA,外周血HMGB1、TLR4含量分别与肺组织中HMGB1mRNA、TLR4mRNA间均呈正相关（r1分别为0.756，0.762，r2分别为0.762，0.327；均P<0.05）；HMGB1和TLR4含量在 BALF和外周血间均呈正相关（r1为0.617，r2为0.325；均P<0.05）。⑽BALF中HMGB1和TLR4含量分别与细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞比例均呈正相关（r1分别为0.796，0.787，0.754，0.749； r2分别为0.730，0.698，0.558，0.480，均P<0.05）。　　结论：①哮喘小鼠气道重塑早期，肺组织高表达HMGB1、TLR4和NF-KB；②HMGB1和TLR4与气道炎症和免疫紊乱有关；适量1,25-(OH)2D3可减轻气道炎症,可能与调节Th1/Th2细胞平衡有关；③哮喘小鼠外周血和支气管肺泡灌洗液中均高表达HMGB1和TLR4蛋白，适量1,25-(OH)2D3可以下调两者的表达；④哮喘小鼠肺组织同时高表达HMGB1、TLR4和NF-KB的mRNA和蛋白，三者与气道重塑相关，适量1,25-(OH)2D3可以下调三者的表达，改善气道重塑；⑤HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路在哮喘发病中起重要作用,适量1,25-(OH)2D3可能通过对其的调控作用阻止哮喘的进展，有望成为哮喘治疗的新选择。