论文部分内容阅读
冠状病毒(Coronavirus, CoV)广泛存在于自然界，可感染包括人类在内的多种动物，主要引起呼吸道、消化道等疾病。部分冠状病毒感染性极强、致死率高，是畜牧业或人类公共卫生相关的重要病原。主蛋白酶(Main protease, 3CLpro)、RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)及刺突蛋白(Spike protein, S)是抗冠状病毒策略开发的三个重要靶标。病毒复制过程中，3CLpro负责病毒多聚蛋白羧基端绝大部分非结构蛋白的切割成熟，RdRp是复制转录复合体(Replication/Transcription Complexes, RTC)核心。3CLpro和RdRp各自在不同冠状病毒中均具有高同源性，和保守的催化机制，是极具有潜力的抗病毒靶标。S蛋白负责冠状病毒与细胞受体的结合以及膜融合，是病毒入侵宿主的首要因素，因此是疫苗及中和性抗体开发的关键靶标。本研究针对冠状病毒复制和入侵过程，以猪养殖业中重要病原猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和当前肆虐全球的严重急性呼吸道冠状病毒2号(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2 )为研究对象，分别对PEDV3CLpro和SARS-CoV-2S蛋白受体结合域(Receptor binding domain, RBD)进行结构相关研究，为抗冠状病毒策略开发提供参考。主要研究内容如下：
1．PEDV3CLpro二聚化和识别多肽底物的分子基础。研究通过分子凝胶排阻以及分析型超速离心证明了PEDV3CLpro以二聚体形式存在于溶液中。随后，解析了野生型PEDV3CLpro的晶体结构。我们基于结构，对二聚体界面关键氨基酸进行突变分析，结果表明：PEDV3CLpro形成紧密的二聚体，单个氨基酸突变难以破坏其二聚体，但会使其活性降低；3CLpro的N端前8个氨基酸(N-finger)的缺失突变会导致二聚体解聚并失活。进一步解析了3CLproC144A突变体与多肽底物的复合物晶体结构，阐明了PEDV3CLpro识别底物的分子基础。PEDV3CLpro在P1位点识别Q；在P2位点偏好识别侧链较大的疏水氨基酸，如L和M等；在P1’位点偏好识别体积较小的氨基酸，如S、G以及A。随后，通过比较对三种不同的荧光多肽底物的水解能力，发现PEDV3CLpro相较于SARS-CoV3CLpro在P1’位点可以识别侧链稍大的氨基酸，如V和N。同时，发现不同冠状病毒3CLpro底物结合口袋中存在一些不保守的基序，这些基序也在一定程度上影响底物识别。
2.GC376靶向PEDV3CLpro抑制病毒复制的结构基础。验证了GC376可有效抑制PEDV3CLpro活性，同时可有效阻止PEDV感染细胞。进一步解析了PEDV3CLpro与GC376复合物的晶体结构，阐明了GC376结合于底物口袋的分子基础。最后，将复合物结构与已解析的TGEV3CLpro-GC376复合物结构进行比较。发现两者结合模式相似，但也存在一些结构差异。
3.SARS-CoV-2受体识别机制。通过设计SARS-CoV-2嵌合体RBD，快速解析了其与受体人血管紧张转化酶2(Human angiotensin-converting enzyme 2, hACE2)的复合物晶体结构。阐明了SARS-CoV-2受体识别分子基础。并发现受体结合基序(Receptor binding motif, RBM)上的4氨基酸基序“GVEG”拉近了其与hACE2的距离，并产生了更多的相互作用，导致其亲和力远高于SARS-CoVRBD与受体hACE2的亲和力，生化试验进一步验证了这一结论。与复合物SARS-CoVRBD-hACE2比较，在SARS-CoV-2RBD-hACE2结合模型中，hACE2上与病毒结合的热点氨基酸K31和K353的构象发生了微妙的变化。K31与hACE2的E35距离拉远，两者均与RBM的Q493形成新的氢键相互作用，从而稳定了自身构象。热点K353在保留与hACE2D38相互作用的同时，与RBM的G496形成了新的主链间氢键相互作用。这两个与病毒结合的热点氨基酸通过调整自身与周围氨基酸的作用从而保持了其自身的稳定，在与病毒RBM的结合中发挥重要作用。研究揭示了SARS-CoV-2在进化过程中发生的巧妙变化，在一定程度上解释了SARS-CoV-2的高传染性，也为抗体药物开发、优化和疫苗的设计提供了结构基础。
综上，本研究以两种重要的冠状病毒PEDV和SARS-CoV-2为研究对象，首先探究了PEDV3CLpro二聚体形成、底物识别特异性以及GC376抑制其活性的分子基础；然后研究了SARS-CoV-2S蛋白识别受体的分子基础。我们以冠状病毒复制和入侵的关键蛋白为靶标，为通过不同靶标开发抗冠状病毒药物、疫苗或抗体提供了结构基础。
1．PEDV3CLpro二聚化和识别多肽底物的分子基础。研究通过分子凝胶排阻以及分析型超速离心证明了PEDV3CLpro以二聚体形式存在于溶液中。随后，解析了野生型PEDV3CLpro的晶体结构。我们基于结构，对二聚体界面关键氨基酸进行突变分析，结果表明：PEDV3CLpro形成紧密的二聚体，单个氨基酸突变难以破坏其二聚体，但会使其活性降低；3CLpro的N端前8个氨基酸(N-finger)的缺失突变会导致二聚体解聚并失活。进一步解析了3CLproC144A突变体与多肽底物的复合物晶体结构，阐明了PEDV3CLpro识别底物的分子基础。PEDV3CLpro在P1位点识别Q；在P2位点偏好识别侧链较大的疏水氨基酸，如L和M等；在P1’位点偏好识别体积较小的氨基酸，如S、G以及A。随后，通过比较对三种不同的荧光多肽底物的水解能力，发现PEDV3CLpro相较于SARS-CoV3CLpro在P1’位点可以识别侧链稍大的氨基酸，如V和N。同时，发现不同冠状病毒3CLpro底物结合口袋中存在一些不保守的基序，这些基序也在一定程度上影响底物识别。
2.GC376靶向PEDV3CLpro抑制病毒复制的结构基础。验证了GC376可有效抑制PEDV3CLpro活性，同时可有效阻止PEDV感染细胞。进一步解析了PEDV3CLpro与GC376复合物的晶体结构，阐明了GC376结合于底物口袋的分子基础。最后，将复合物结构与已解析的TGEV3CLpro-GC376复合物结构进行比较。发现两者结合模式相似，但也存在一些结构差异。
3.SARS-CoV-2受体识别机制。通过设计SARS-CoV-2嵌合体RBD，快速解析了其与受体人血管紧张转化酶2(Human angiotensin-converting enzyme 2, hACE2)的复合物晶体结构。阐明了SARS-CoV-2受体识别分子基础。并发现受体结合基序(Receptor binding motif, RBM)上的4氨基酸基序“GVEG”拉近了其与hACE2的距离，并产生了更多的相互作用，导致其亲和力远高于SARS-CoVRBD与受体hACE2的亲和力，生化试验进一步验证了这一结论。与复合物SARS-CoVRBD-hACE2比较，在SARS-CoV-2RBD-hACE2结合模型中，hACE2上与病毒结合的热点氨基酸K31和K353的构象发生了微妙的变化。K31与hACE2的E35距离拉远，两者均与RBM的Q493形成新的氢键相互作用，从而稳定了自身构象。热点K353在保留与hACE2D38相互作用的同时，与RBM的G496形成了新的主链间氢键相互作用。这两个与病毒结合的热点氨基酸通过调整自身与周围氨基酸的作用从而保持了其自身的稳定，在与病毒RBM的结合中发挥重要作用。研究揭示了SARS-CoV-2在进化过程中发生的巧妙变化，在一定程度上解释了SARS-CoV-2的高传染性，也为抗体药物开发、优化和疫苗的设计提供了结构基础。
综上，本研究以两种重要的冠状病毒PEDV和SARS-CoV-2为研究对象，首先探究了PEDV3CLpro二聚体形成、底物识别特异性以及GC376抑制其活性的分子基础；然后研究了SARS-CoV-2S蛋白识别受体的分子基础。我们以冠状病毒复制和入侵的关键蛋白为靶标，为通过不同靶标开发抗冠状病毒药物、疫苗或抗体提供了结构基础。