论文部分内容阅读
研究背景：中性粒细胞即多形核细胞（Polymorphonuclear cells，PMNs）是机体最重要的炎性细胞，当外来病原菌进入机体时，PMNs就会向病原菌处集结，进行吞噬活动，继而消化和降解病原体，发挥天然免疫清除病原体的效应。以往的研究表明，机体感染结核分枝杆菌（Mtb）后，发挥抗结核免疫主要是细胞免疫，而且Mtb通过补体受体进入巨噬细胞并通过干扰巨噬细胞吞噬和溶酶体成熟而长期存活造成潜伏感染。但最近的资料显示，在急性结核病发病早期，PMNs首先吞噬Mtb，并且PMNs是活动性肺结核病人感染过程中占最主导地位的吞噬细胞，而其发挥的生物学效应却绝不仅仅是简单的吞噬作用。探讨PMNs杀伤Mtb的活性以及在抗结核感染的天然免疫作用，对于全面了解机体抗结核感染的免疫保护机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。目的：探讨用FDA和BCECF-AM标记Mtb的最佳浓度和完善用流式细胞术检测人外周全血PMNs杀伤Mtb的实验方法，观察不同化学试剂和温度对PMNs杀伤Mtb的影响；观察Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，Th2型细胞因子IL-4以及共同细胞因子GM-CSF，Th17型细胞因子IL-17对人外周血PMNs杀伤Mtb活性的影响。方法：1.用不同浓度荧光素二醋酸酯（FDA）和2’,7’-二羧乙酸-5（和6）-羧基荧光素二乙酰甲酯（BCECF-AM）在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）标记Mtb，流式细胞术检测标记率和荧光强度（MFI）。2.取用FDA和BCECF-AM标记率的Mtb，分别在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中，孵育30min后，洗涤和溶血，用流式细胞术检测标记率和荧光强度（MFI）。3.用不同百分比的乙醇、甲醛和多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）试剂，与用FDA和BCECF-AM标记且标记率>95%的Mtb，在室温下孵育30min后洗涤，用流式细胞术检测标记率和荧光强度（MFI）。4.取健康成人外周血与FDA和BCECF-AM标记的Mtb于37℃孵育7min，洗涤溶血，加入自体血清，置37℃孵育0～60min，流式细胞术检测标记Mtb的FDA和BCECF-AM的标记率减少计算PMNs对Mtb的杀伤率。5.取健康人外周血用Percoll分离获得PMNs，与FDA和BCECF-AM标记的Mtb于37℃孵育7min，洗涤，加入自体血清，置37℃孵育0～60min，流式细胞术检测标记Mtb的FDA和BCECF-AM的标记率减少计算PMNs对Mtb的杀伤率。6.取健康人外周血预先分别加入不同浓度的Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，Th2型细胞因子IL-4和共同细胞因子GM-CSF以及Th17型细胞因子IL-17，37℃孵育1h，再加用FDA标记的Mtb分别孵育7min，洗涤溶血后，加入自体血清，再置37℃孵育30min，流式细胞术检测标记Mtb的FDA的标记率减少计算PMNs对Mtb的杀伤率。结果:1. Mtb用不同浓度FDA（0.025μM～2.0μM）和BCECF-AM（0.025μM～2.0μM）在PBS中标记的标记率分别从由85%增加到99%，由33%增加到99%，均有显著性差异（p <0.01）； MFI分别从45增加到1506，从25到2202，亦均有显著性差异（p <0.01）；2. FDA标记的Mtb和BCECF-AM标记的Mtb在0℃冰浴，37℃、65℃、95℃水浴作用30min后，FDA-Mtb的标记率从0℃的99%下降至65℃的62%，并且随着温度的升高继续下降，到95℃时标记率几乎为零（0.21%），有显著性差异（p<0.01），MFI从0℃的2015下降至95℃时的87，也有显著性差异（p <0.01）；BCECF-Mtb的标记率从0℃的99%到95℃时标记率几乎为零（0.18%），有显著性差异（p <0.01），MFI从0℃的2344，到95℃时为93，也有显著性差异（p<0.01）；3. FDA标记的Mtb和BCECF-AM标记的Mtb与不同比例的常规化学试剂乙醇、甲醛、多聚甲醛分别作用30min后，FDA-Mtb的MFI在乙醇组，从对照组的1597下降至325；在甲醛组下降至118；在多聚甲醛组降至185，均有显著性差异（p<0.01）；BCECF-Mtb的MFI在乙醇组，从对照组的1318下降至708；甲醛组下降至187，多聚甲醛组下降至648，均有显著性差异（p <0.01）；4. FDA标记的Mtb与全血在37℃作用0min、10min、30min和60min，PMNs杀伤Mtb的百分率分别是14.95、20.59、31.50、44.58；与分离PMNs在37℃作用0min、10min、30min和60min，PMNs杀伤Mtb的百分率分别是11.37、12.02、27.20、58.44。两者在37℃作用0～60min PMNs杀伤Mtb的百分率呈递增趋势(p<0.01)；同样的，BCECF-AM标记的Mtb与全血在37℃作用0min、10min、30min和60min， PMNs杀伤Mtb的百分率分别是18.83、19.64、34.65、40.17；Mtb与分离PMNs在37℃作用0min、10min、30min和60min，PMNs杀伤Mtb的百分率分别是15.94、18.74、29.46、38.44。两者在37℃作用0～60min PMNs杀伤Mtb的百分率呈递增趋势(p <0.01)5.用不同浓度IL-2（40~320U/ml）预处理人PMNs1h后，PMNs30min杀伤百分率与对照组比较在40U/ml时即有增加，且随浓度增加杀伤率增高（p <0.01），320U/ml杀伤率达48%。不同浓度IFN-γ（200~1600U/ml）预处理人PMNs1h，杀伤率随浓度增加而增高（p <0.01），200U/ml时杀伤率为28%，1600U/ml时可达到56%6.不同浓度IL-4（50~400U/ml）预处理人PMNs1h后，PMNs30min杀伤百分率与对照组比较在50U/ml时降低到23%，随浓度增加杀伤率降低（p <0.05），在400U/ml时降低到12%。不同浓度GM-CSF（50~400U/ml）预处理人PMNs1h后，PMNs杀伤Mtb30min百分率和对照组相比较，差异无统计学意义（p>0.05）7.不同浓度IL-17（0.8~6.4ng/ml）预处理人PMNs1h后，发现PMNs30min杀伤百分率与对照组比较在0.8ng/ml时即有增加，且随浓度增加杀伤率增高（p<0.01），在6.4ng/ml时增加到56%。结论：1.流式细胞术能快速准确地检测不同FDA和BCECF-AM浓度对Mtb标记率和MFI的影响，并且两种荧光素均能稳定标记Mtb。2.不同温度、不同比例乙醇、甲醛、多聚甲醛对Mtb作用，Mtb的存活率与流式细胞术检测的标记率和MFI成正相关。3.流式细胞术可以检测出人外周全血PMNs和全血分离PMNs对FDA-Mtb和BCECF-Mtb的杀伤活性，并发现杀伤活性随时间延长而增强。4. Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ和Th17型细胞因子IL-17均有助于增强PMNs杀伤Mtb的功能，Th2型细胞因子IL-4则降低PMNs杀伤Mtb功能，表明这些细胞因子在PMNs抗结核免疫中具有调节作用。