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目的:进一步确证有机锡化合物二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡(DBDCT)对细胞色素P450 3A(CYP3A)抑制作用机制。本文研究DBDCT对孕烷X受体(PXR)介导CYP3A表达的影响,分析PXR是否参与DBDCT对CYP3A的抑制过程,考察DBDCT是否可以引起核因子κB(NF-κB)的活化,以及NF-κB对PXR介导CYP3A表达途径的影响,探讨DBDCT是否可以通过活化NF-κB抑制PXR介导的CYP3A转录表达过程。方法:(1)利用双荧光素酶报告基因系统,研究DBDCT对PXR介导的CYP3A转录表达的影响;(2)采用Western blot方法分别对DBDCT作用前后的Hep G2细胞全蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白进行检测,分析DBDCT作用前后NF-κB总量的变化及其在胞浆、胞核中表达量变化情况;同时,采用免疫荧光法研究DBDCT作用前后NF-κB由胞浆转运至细胞核内的情况,以研究NF-κB是否可以被DBDCT激活;(3)采用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法和双荧光素报告酶实验,研究DBDCT激活的NF-κB对DBDCT作用后PXR介导的CYP3A转录调节途径的影响;(4)利用RNA干扰技术分别干扰PXR和NF-κB的表达,采用FQ-PCR方法检测DBDCT对Hep G2细胞中CYP3A m RNA表达水平的影响,验证DBDCT对CYP3A的抑制过程与PXR和NF-κB的关系,进一步明确抑制作用的机制。结果:(1)DBDCT可以诱导人或大鼠PXR介导的CYP3A基因转录表达,且呈量效关系,与空白对照组相比,0.5μM、1μM和2μM的DBDCT作用24h可以通过r PXR诱导CYP3A1表达升高至1.37、2.06和4.34倍(p<0.05、p<0.001、p<0.001),以这三种浓度的DBDCT作用24h后h PXR介导的CYP3A4表达升高至2.16、3.72及4.86倍(p<0.05、p<0.001、p<0.001);同时该诱导作用也存在良好的时效关系,以0.5μM的DBDCT分别作用24h、48h、72h,结果显示作用时间越长对PXR介导CYP3A表达的诱导作用越强。(2)Western blot法测得DBDCT作用前后细胞全蛋白中NF-κB的表达量未见显著性变化(p>0.05),但与空白对照组相比1μM和2μM的DBDCT可使细胞胞浆中NF-κB的表达量下降至0.70和0.61倍(p<0.01、p<0.01),使细胞核内NF-κB的表达量增至1.31和2.00倍(p<0.01、p<0.01)。免疫荧光法也证明DBDCT作用后NF-κB由胞浆转运至胞核,提示DBDCT可以活化NF-κB。(3)NF-κB的激活剂LPS可以使CYP3A4的m RNA表达水平明显下降;DBDCT也可以使CYP3A4的m RNA表达水平降低,且该作用可以由NF-κB抑制剂PDTC逆转。此外,在双荧光素报告酶实验中,向转染后的细胞中加入DBDCT可诱导CYP3A4表达升高,共转染时加入NF-κB质粒后该诱导作用被下调,下调程度随着NF-κB的加入量的增加而增加,共转染时加入NF-κB的抑制因子IκBα可以减弱NF-κB质粒对CYP3A4表达的影响。这些结果显示DBDCT对CYP3A4的抑制作用与NF-κB相关。(4)0.5μM、1μM和2μM的DBDCT对CYP3A4 m RNA的表达水平均有下调作用,与空白对照组相比表达量分别降低至0.75、0.64和0.44倍(p<0.05、p<0.05、p<0.01)。干扰PXR表达后,DBDCT对CYP3A4 m RNA表达具有更强的抑制作用。干扰NF-κB p65表达后,DBDCT对CYP3A4 m RNA表达的下调作用有所减弱。结论:(1)DBDCT可以通过PXR的调节诱导CYP3A表达;(2)DBDCT可以激活NF-κB,且所激活的NF-κB可作用于PXR介导的CYP3A4转录调节过程,下调CYP3A4的表达。