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研究背景和目的肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在全球恶性肿瘤中居首位,全世界每年肺癌发生超过150万例。其中非小细胞肺癌(NSCLC,non-small cell lung cancer)约占肺癌的80%,30%-40%的NSCLC在诊断时已失去手术根治的机会[1]。化疗是晚期NSCLC的主要治疗手段,含铂两药方案化疗是目前晚期NSCLC一线治疗的标准方案,但无论化疗药物如何组合,经化疗的晚期NSCLC患者中位生存期约为8至10个月左右,一年生存率在30%-40%左右,其疗效似乎已经达平台。近年来,随着肿瘤分子生物学,肿瘤免疫学以及细胞生物学学科的迅猛发展,分子靶向治疗应运而生。分子靶向治疗针对细胞内或表面特定分子,特异性强,不良反应少,是目前肿瘤治疗的一个研究热点。表皮生长因子受体(EGFR)是受体ErbB家族的一员,可促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞凋亡,提高肿瘤细胞的运动、黏着和侵袭能力,从而增加肿瘤向周边及远处侵袭转移的机会,有研究表明EGFR的高表达与肺癌的发生发展关系密切[2]。吉非替尼是2003年首个获美国食品和药物管理局(FDA)批准用于既往化疗失败的晚期NSCLC治疗的口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Gefitinib,ZD1839,Iressa,易瑞沙)。两项随机、Ⅱ期临床试验IDEAL1&2研究显示,对于化疗后复发的晚期NSCLC,吉非替尼可作为二线或三线治疗,不良反应轻,耐受性好,可长期使用[3,4]。IPASS[5]研究将吉非替尼作为一线治疗与一线化疗进行对比,结果显示,吉非替尼一线治疗无进展生存(PFS)显著优于TP联合化疗,最终OS数据无显著差异(18.8个月vs.17.4个月)。随后的三期临床试验NEJGSG002和WJTOG3405研究表明对于EGFR基因突变的晚期NSCLC,吉非替尼PFS优于化疗,有延长总生存的趋势[6,7]。吉非替尼于2011年被FDA批准应用于EGFR基因突变晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。考虑到化疗药物与EGFR-TKIs作用机制不同,人们寄希望于吉非替尼联合化疗能使晚期NSCLC疗效提高。目前体外研究表明,吉非替尼与传统化疗药物合用(包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、多柔比星等)可以增强这些化疗药物抑制癌细胞增殖的效果,提示吉非替尼在体外具有协同化疗药物抗癌的作用,并且这一结果在动物试验中得以证实[8]。但多个大型临床研究INTACT1(健择／顺铂联合吉非替尼)[9]、INTACT2(紫杉醇／卡铂联合吉非替尼)[10]和TRIBUTE(紫杉醇／卡铂联合厄罗替尼)[11]、TALENT(吉西他滨／顺铂联合厄罗替尼)[12]均显示EGFR-TKIs与化疗同时作用在有效率及生存期方面并未优于单独化疗,且不能提高无疾病进展时间和疾病控制率。这种实验室研究与临床研究不符的结果,引发了两个问题：(1)EGFR-TKIs与化疗联合使用是否存在“优势人群”。(2)EGFR-TKIs与化疗的联合使用的最佳方式是如何。(3)假设EGFR-TKIs与化疗存在最佳给药方式,那么其细胞学机制是如何。因此,本研究的第一个目的是通过观察多西他赛和吉非替尼不同顺序用药对EGFR野生型和EGFR突变型细胞生长的影响,寻找NSCLC细胞不同EGFR突变状况的最佳给药方式。化疗与EGFR-TKIs二者联合应用增效与否的细胞学机制不明。既往的研究显示,化疗同时应用EGFR-TKIs不增效的发生机制可能与细胞周期有关[13,14],化疗后序贯应用EGFR-TKIs产生协同增效作用可能与EGFR磷酸化有关[15]。近年的研究表明IGF-1R亦可通过细胞内信号蛋白PI3K/AKT影响细胞对化疗及EGFR-TKIs敏感性[16,17]。因此,本研究的第二个目的旨在通过观测多西他赛与吉非替尼不同时序应用对EGFR野生型及突变型肺腺癌细胞的EGFR、IGF-1R表达及磷酸化影响、细胞内信号蛋白ERK、AKT表达及磷酸化影响及细胞周期变化,寻找可能的细胞学机制。方法1、高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high-resolution melting,qPCR-HRM)检测A549及PC-9细胞EGFR及Kras基因突变；四甲基偶氮哇盐(MTT)比色法检测两株细胞生长曲线,多西他赛与吉非替尼单药及联合应用对两株细胞的生长作用；Western blotting检测细胞信号蛋白的影响；流式细胞术检测细胞周期变化2、统计方法统计学处理采用SPSS13.0软件进统计学分析,以均数±标准差(Mean±SD)表示,相关各组间采用One-way ANOVA检验,不同组间比较采用LSD检验,P<0.05判断为差异具有统计学意义。结果1、细胞EGFR和K-ras基因状况A549细胞的EGFR基因无突变,K-ras基因第2外显子为突变型；PC-9细胞的EGFR基因第19外显子突变,K-ras基因无突变。2、多西他赛与吉非替尼对细胞生长影响正常培养的两株肺腺癌细胞生长均呈无限繁殖,A549细胞第2天进入对数生长期,PC-9细胞第3天进入对数生长期。多西他赛(10-4M-10-10M)和吉非替尼(A549为10-2M-10-8M；PC-9为10-4M-10-10M)呈浓度依赖性抑制A549和PC-9细胞生长。多西他赛和吉非替尼作用72h抑制A549细胞生长的ICso值分别为5.24x10-7mol／L和1.28×10-5mol／L,抑制PC-9细胞生长的ICso值分别为2.13×10-8mol／L和4.58×10-8mol／L。吉非替尼抑制PC-9细胞生长的作用明显强于A549(P<0.05),两株细胞相差近1000倍。多西他赛序贯吉非替尼对两株细胞生长抑制均具显著增效作用,对A549及PC-9抑制增效率分别为9.34%(P<0.05)和8.94%(P<0.05),但同时用药只对PC-9细胞具增效作用(增效7.56%,P<0.05)。3.多西他赛与吉非替尼不同时序应用对细胞信号蛋白的影响IC50浓度的多西他赛和吉非替尼分别增强和抑制两株细胞EGFR和ERK磷酸化、均抑制PC-9细胞IGF-1R磷酸化。多西他赛诱导的EGFR和ERK磷酸化显著被序贯应用的吉非替尼抑制。两药同时应用对抑制PC-9细胞的IGF-1R磷酸化具增强作用。4.多西他赛与吉非替尼同时及序贯应用对细胞周期的影响多西他赛将A549及PC-9细胞阻滞在G2期(分别增加43.28%和30.13%,P<0.05)。吉非替尼对A549无明显的G1期阻滞作用,但将PC-9细胞明显阻滞在G1期(增加29.98%,P<0.05)。多西他赛序贯吉非替尼组将两株细胞明显阻滞在G2期,较对照组上升约54.11%和40.77%(P<0.05)。同步组和吉非替尼序贯多西他赛组两株细胞的各期细胞无明显变化。结论本研究发现：1、人肺腺癌细胞A549细胞为EGFR野生型；PC-9细胞为EGFR突变型。细胞生长试验显示A549和PC-9细胞分别为吉非替尼耐药型和敏感型,对吉非替尼的敏感性相差1000倍,结果与既往报道的一致。2、多西他赛序贯吉非替尼对EGFR基因野生型和突变型的细胞A549及PC-9细胞生长均具增效作用,可能与影响细胞EGFR和ERK磷酸化有关。同时应用仅对基因突变的PC-9细胞具增效作用,可能与IGF-1R磷酸化抑制有关。先吉非替尼后多西他赛对两株细胞均无增效作用可能与细胞周期相关。