【背景】目前肺癌缺乏有效的早期诊断和预后预测的分子标志群,单一生物标志物对于类型多样的肺癌缺乏特异性和敏感性,多种分子标志联合筛检是早期筛查的研究方向,鉴定并克隆出肺癌的特异性或相关性基因将为临床提供有价值的诊断指标。【目的】通过构建肺癌T7噬菌体展示肽库,筛选出临床上能用于肺癌早期检测的分子标志群。【方法】(1)肺癌T7噬菌体展示肽库的构建用传统的Trizol方法分别抽取了30例涵盖各种组织类型的肺癌组织标本的总RNA,确定完整性后再根据OD值等量混合总RNA,用试剂盒完成mRNA的分离并电泳检测其质量,经反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、去除多余接头和小于300bp的cDNA片段等步骤,再与T7select10-3b载体连接、体外包装得到肺癌T7噬菌体展示cDNA原始文库。(2)测定原始噬菌体展示肽库的库容量和重组率,扩增肽库并测其滴度从原始展示肽库中取10μl噬菌体液做1:100倍比稀释,将100μl不同稀释度的噬菌体液、250μl BLT5403菌液、3ml预热并保温55℃的顶层琼脂迅速摇匀后倒入至保温37℃的LB/AMP平皿,待冷却后倒放在37℃恒温箱孵育4h,按“文库容量=∑(各平板的噬菌斑个数×该平板的稀释倍数×10×文库体积)/平板数”计算库容量。随机挑取20个噬菌斑分别放入已加100μl 10mM EDTA(PH 7.5)的EP管中,65℃加热10min,14000rpm离心3min,上清(即含有噬菌体的DNA)PCR扩增后行1.5%琼脂糖凝胶电泳观察插入片段大小。计数有插入片段的标本,计算重组率。取10μl扩增库噬菌体液用同样平皿法孵育,取可见噬菌斑的稀释度最低的平皿,计数噬菌斑,以其个数×10×稀释度作为扩增噬菌体液的滴度。(3)肺癌组患者和对照组患者血浆中IgG的富集取10μl结合protein A/G的琼脂糖珠于每一支1.5 ml Eppendorf管中,分别与15μl肺癌组患者、对照组患者的血浆4℃孵育过夜富集抗体。SDS-PAGE电泳验证富集到的抗体后将20管肺癌组的抗体及20管对照组的抗体各自合并成一管。(4)肺癌特异性相关肽的富集为了富集可以和肺癌自身抗体特异结合的展示肽,我们对肺癌T7噬菌体展示肽库进行了正反向的5轮亲和筛选。取噬菌体扩增液30μl用10%BSA 1:40稀释,先与20μl的对照组抗体4℃孵育2小时,未结合的上清再与20μl肺癌组抗体混合4℃孵育过夜,保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体再扩增,此为一轮筛选,如此反复五轮。每轮筛选后均测定重组率和滴度。(5)肺癌特异标志物的筛选为了找到确实可在临床上实际应用的肺癌特异标志物,随机挑取五轮筛选后的3000个噬菌体克隆用ELISA方法进一步两轮筛选。在酶标仪450nm波长下读取OD值。按下列公式计算并判断结果:用空白孔调零后,样品OD值/阴性对照平均OD值,比值≥2.0,判断为阳性;样品OD值/阴性对照平均OD值,比值<2.0,判断为阴性。阴性对照OD值低于0.05作0.05计算,高于0.05按实际OD值计算。肺癌组为阳性、非肺癌为阴性的噬菌体即为有意义的、具有诊断肺癌潜能的样本。(6)测序和蛋白功能预测ELISA筛选出的噬菌体克隆,测序后经过NCBI上的BLAST序列比对找到完全一致或者最接近的已知基因序列,推测我们获得的基因的是否与癌症相关。【结果】(1)构建成原始文库的库容量为5.4×10~6 pfu/ml,重组率为60%.扩增库的滴度为9.6×10~8pfu/ml。(2)五轮亲和筛选后噬菌体肽库的重组率和滴度均有了很大的提高,反映出具有某些特征的噬菌体得到了富集。(3)重复两轮ELISA共筛选出13个有意义的噬菌体。其测序结果获得后,其中1个为未知其功能的新基因(817号和1525号为同一未知功能的新基因),其余的均有报道与癌症相关,且这13个基因中包含三组相同的基因。【结论】(1)T7噬菌体构建的cDNA文库可以很好的展示各种小丰度蛋白。(2)经过五轮亲和筛选表达肺癌特异抗原的噬菌体得到富集。(3)ELISA筛选出的一组噬菌体表达的抗原可能是潜在的肺癌诊断分子标志群。