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甲状旁腺激素(PTH)是脊椎动物体内调节钙、磷代谢平衡的主要激素之一,由甲状旁腺的主细胞产生,其主要的靶器官是骨骼、小肠和肾脏。本研究利用基因重组技术,取45周龄的产蛋新扬州鸡甲状旁腺组织,提取RNA后通过RT-PCR方法成功的扩增出鸡甲状旁腺激素基因cDNA,通过TA克隆将扩增所得cDNA片断插入载体pGEM-T内,通过测序分析得出新扬州鸡甲状旁腺cDNA碱基序列与GenBank上已经发表的序列比较有100%的同源性。 蛋鸡蛋壳品质问题和肉鸡腿病问题正日益对家禽生产构成严重危害。为了寻找一种廉价而有效的解决方法,我们考虑到了选择基因治疗方法。为此我们将扩增所得的鸡甲状旁腺激素基因cDNA片段,通过基因重组技术将其插入真核表达载体pCDNA3和pCEP4中,分别构建pCDNA3-PTH和pCEP4-PTH真核表达构件。将所得的两个表达构件通过转化DH5 α细菌,然后通过筛选、鉴定得重组子,将重组子扩培后提质粒,将提取的质粒纯化后注射入实验动物鸡体内,每次每只实验鸡腿部注射400ug,每个真核表达构件注射3只产蛋扬州鸡,另有3只产蛋鸡作对照,对照组注射400u15%的葡萄糖溶液。每次注射前空腹采血5ml,每隔2周注射一次质粒,共注射质粒2次,采血4次,所采血样均放置-70℃低温冰箱保存,取样结束后一次性分析。 试验结果: (1)将通过RT-PCR所得的cDNA片段克隆到载体PGEM-T中后测序,所得结果与GenBank中发表的序列对比,发现有100%的同源性。 (2)将构建好的真核表达构件pCDNA3-PTH和PCEP4-PTH注射入实验鸡体内后均发现血清中血磷下降,血钙升高。血清磷与血清钙之间有相关性(p<0.05)。 (3)通过放射免疫分析血清中的甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)和雌激素(E2)后发现:PTH、CT水平在注射质粒后各试验组出现了分泌增加趋势,且注射质粒pCEP4-PTH组比较注射注射质粒pCDNA3-PTH组有更大的上升幅度。E2水平在整个试验过程中有上升的趋势。