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本研究在鸡胚胎成肌细胞(CFM)中筛选肌肉生长抑制素Myostatin的靶基因时发现CARP的表达能够被Myostatin所抑制。鸡CARP定位在第6号染色体上,跨越约8800个碱基,含有9个外显子。这个基因编码319个氨基酸的蛋白,含有4个非常保守的锚定重复序列,两个PEST序列和一个核定位信号。进一步分析显示,在鸡胚胎成肌细胞(CFM)中,Myostatin以剂量依赖的方式抑制CARP表达;表达谱分析表明,在鸡中CARP的表达呈骨骼肌特异性,并仅在出生后表达;在体外细胞实验表明,CARP在仅分化的骨骼肌细胞中表达。通过免疫荧光和构建绿色荧光蛋白-CARP融合真核表达载体,发现CARP在CFM和C<,2>C<,12>细胞中都主要在细胞核中表达。过表达CARP可以促进CFM细胞增殖,细胞周期分析表明,过表达CARP促进G1-S期转移,增加S期在细胞周期中所占的百分含量,通过RNAi或反义策略敲低CARP抑制细胞增殖和分化甚至造成细胞死亡。半定量RT-PCR分析发现,在CFM细胞中抑制CARP表达可导致p27、CyclinD1、caveolin-3和MyoD的表达下调。另外,过表达CARP能够减弱Myostatin对鸡成肌细胞增殖的抑制作用。说明Myostatin通过CARP在禽类肌肉发生中发挥重要作用。此外,利用病毒包装系统,在C<,2>C<,12>细胞中过表达CARP能够促进细胞增殖。
以前的报道表明CARP是一个转录调节因子,CARP结构中含有四个锚定重复序列,推测可能通过与其他蛋白相互作用来发挥其功能。以CARP为诱饵蛋白,利用酵母二元杂交体系从人的骨骼肌cDNA文库中筛选可与CARP相互作用的蛋白。在酵母中,得到了以下蛋白可以和CARP相互作用:NY-CO-1(New York Colonantigen 1)、亨廷顿基因相互作用蛋白K、葡萄糖磷酸变位酶1、TAp63γ、肌肉谷胱甘肽-S-转移酶2、肌动蛋白、肌红蛋白、Titin、SAKS1(具有UBA/UBX结构域的ORF)。CARP与结构蛋白Titin和转录因子TA p63γ相互作用,说明CARP有可能作为从结构蛋白到转录因子的桥梁分子,在信号传导过程中起着重要作用;与SAKS1相互作用,为CARP作为一种快速应激蛋白在自身降解过程中发挥作用提供了新的信息。
为了验证CARP和TA p63γ之间的相互作用,首先应用免疫荧光技术发现CARP和TA p63γ共定位在细胞核中;通过pull-down和Co-IP实验证明两者的相互作用是特异的。然后,进一步分析了CARP和TA p63γ相互作用的生物学功能,通过用真核表达的CARP与TA p63γ质粒转染HeLa细胞,发现CARP能够减弱TA p63γ诱导的细胞凋亡。综上所述,CARP作为转录调节因子,促进细胞增殖并有可能参与Myostatin调节的信号通路。CARP是通过与其他蛋白相互作用来发挥其功能,对其结合蛋白的研究有助于揭示CARP的作用机理,不仅为揭示骨骼肌生长发育的调控机制的具有重要意义,同时也为阐明CARP在骨骼肌生长、分化、凋亡中的分子作用机理提供重要理论依据。