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烧伤早期出现的心肌细胞骨架损伤可能是烧伤后细胞能量代谢障碍的重要机制之一。本课题组以往的系列研究表明,细胞骨架的形态结构和功能正常与否对胞内线粒体功能和细胞能量代谢具有直接而重要的影响。因此,我们提出了从细胞骨架的调控入手,寻找微管与线粒体间的桥梁分子,减轻缺氧后线粒体通透性转换,改善心肌细胞能量代谢的思路。研究发现,过表达MAP4有助于维持缺氧心肌细胞微管的稳定,明显改善缺氧早期(Hypoxia<3h)心肌细胞ATP和能荷水平,维持细胞活力,改善和维持缺氧早期心肌细胞能量代谢及生理活性。应用酵母双杂交技术,我们筛选出与线粒体外膜MPTP主要成分VDAC(VDAC1)可能存在相互作用的新蛋白质分子——动力蛋白轻链1,认为Dynlt1可能是微管(MT)对线粒体通透性转换孔(MPTP)进行调控作用的中间桥梁分子,其具体结构方式为:MitoVDAC - Dynlt1 / Dynein - MT。本课题旨在研究Dynlt1通过稳定VDAC,进而减轻缺氧早期线粒体通透性转换,以证明“细胞骨架在缺氧心肌细胞能量代谢障碍中具有重要作用”的假设。材料与方法1、以免疫组化双标记、co-IP等技术手段,观察体外培养的新生大鼠心肌细胞和HeLa细胞中Dynlt1及VDAC表达定位,并验证在哺乳动物细胞中Dynlt1-VDAC、Dynlt1-MT是否存在相互作用。进一步观察破坏微管结构之后,Dynlt1的分布变化规律及与微管的关系。2、用包含MAP4基因的重组腺病毒载体,转染HeLa细胞。激光共聚焦扫描显微镜观察过表达MAP4对细胞微管的稳定作用,并观察此过程中Dynlt1的表达变化,应用MTT法检测细胞活力,四甲基罗丹明乙酯(TMRE)观察线粒体膜电位(ΔΨ),酯化钙黄绿素(Calcein-AM)观察MPTP开放程度。进而明确过表达MAP4可以稳定微管,同时Dynlt1含量增加可减轻缺氧早期线粒体通透性转换。3、以Dynlt1 shRNA Plasmid转染HeLa细胞,形成稳定转染的细胞克隆,构建持续低表达Dynlt1的细胞株HeLa-dD。运用MTT、TMRE、Calcein-AM等手段观察低表达Dynlt1后,细胞相对活力、ΔΨ、MPTP开放程度,以及在此条件下过表达MAP4之后对细胞活力的影响。主要结果与结论1.胞浆中Dynlt1与MT、Dynlt1与VDAC有着明显的共区域分布特征,大量Dynlt1沿微管结构区域伴行分布,常氧下VDAC几乎都与Dynlt1有密切共定位。Dynlt1分子与细胞中的微管结构在空间分布上具有紧密关系,同时Co-IP证明Dynlt1与VDAC具有确切的蛋白质相互作用,提示两者在功能方面有密切的相互影响。2.胞内Dynlt1的分布因微管的破坏而变化,微管破坏的同时使Dynlt1分子从微管上脱落,并且随着缺氧时间延长,Dynlt1分子脱落的程度加剧。说明微管与Dynlt1在结构分布和其所发挥作用的时空上具有密切的关系。缺氧使线粒体受破坏,线粒体外膜的VDAC也因线粒体的破坏而含量减少。提示Dynlt1与VDAC在胞浆中有广泛结合。3. MAP4过表达可以确切的维护缺氧早期细胞活力,并减轻缺氧所致的微管结构破坏;可以维护细胞线粒体膜电位,减少线粒体通透性转变;过表达MAP4可以上调Dynlt1的表达,且这一作用非常强烈。4.稳定转染Dynlt1 shRNA慢病毒质粒,形成了持续低表达Dynlt1的细胞株HeLa-dD。在此基础上初步探讨了“Dynlt1表达增强”与“MAP4改善缺氧细胞能量代谢障碍维护缺氧条件下细胞活力”两者之间是否具有因果关系。结果证实,下调Dynlt1表达后,缺氧15min即可以剧烈的使细胞出现缺氧相关损害,细胞活力降低、线粒体膜电位破坏,MPTP开放增加,而且这些破坏性变化与是否过表达MAP4没有关系。