研究背景内脏高敏感的发生部位深且定位模糊,同时伴有牵涉痛和植物神经反射等临床表现和特点,由于人们对内脏高敏感的认识远滞后于对躯体痛的了解,使得慢性内脏高敏感缺乏特异性的治疗措施;既往关于小鼠内脏高敏感的机制研究发现TRPV1通道与内脏高敏感的发生发展密切相关,且一系列的分子或通路如P物质、神经生长因子等对TRPV1通道具有调控作用,但是具体的调控机制尚未阐述明确,TRPV1通道是一个含有6次跨膜结构的非选择性通透阳离子的离子通道,能够被辣椒素、各种炎性介质(缓激肽、蛋白酶等)、以及内源性大麻素和花生四烯酸等激活;由于能够响应多种刺激,TRPV1也被称为多觉感受器,主要分布在初级感觉神经纤维以及胃肠道、血管平滑肌细胞、T细胞等非神经组织中,其在痛觉信息的传递、调控以及整合方面能够发挥重要作用。目前发现的能激活TRPV1通道蛋白的刺激物大部分是外源性的化学或物理刺激,而内源性的对TRPV1通道参与内脏高敏感过程具有调节作用的分子和通路的报导比较局限,分子及通路间作用机制尚未阐述清楚,转录组测序能够很快锁定与表型变化相关的基因及其显著富集的生物功能和代谢通路,是研究内脏高敏感的一种新方式,但是电针缓解内脏高敏感相关的转录组学特征研究比较缺乏。我们既往研究了电针干预对酵母聚糖诱导的直结肠高敏感模型小鼠脊神经节神经元中TRPV1及P物质的调控,发现:①电针缓解小鼠直结肠高敏感行为与下调高敏感模型小鼠脊神经节神经元中高表达的TRPV1、SP有关。②小型非肽能神经元是TRPV1通道参与电针缓解小鼠直结肠高敏感在脊神经节上的主要神经纤维。基于此我们推测:①TRPV1在初级感觉神经元的活化在内脏高敏感病理形成中扮演重要角色,电针缓解内脏高敏感是通过抑制TRPV1通道的活化、降低组织通透性,减少致痛物质释放,抑制兴奋性神经递质分泌,从而降低了伤害性信息向高级中枢的夸大传递;②TRPV1通道参与电针缓解内脏高敏感过程是由一系列级联的信号通路推动完成的。研究目的获取电针调控小鼠直结肠高敏感过程中参与调控TRPV1通道的分子通路,挖掘潜在的调控基因,阐明电针调控小鼠直结肠高敏感转录组水平的TRPV1调控机制,为确立TRPV1通路作为电针调控外周致痛物质的释放、脊神经节神经元可塑性变化及神经递质分泌的靶点提出更充分的科学依据,为临床IBS患者治疗提供新思路新靶点。研究方法第一部分:普通级健康雄性C57BL/6小鼠24只(20-30g),随机分为4组:盐水对照组(S+C)6只、盐水电针组(S+A)6只、高敏感模型对照组(Z+C)6只、高敏感模型电针组(Z+A)6只;实验小鼠在第一天进行直结肠球囊扩张测试(CRDO),第3、4、5天连续3天给予酵母聚糖悬浮液(Zymosan,30 mg/mL,0.2ml/只)或等量生理盐水肛门注射;第7、9、11天所有实验小鼠均进行CRD测试(CRD1、CRD2、CRD3),通过腹壁回撤反射评分(AWR评分)评估小鼠的直结肠敏感性;并分别在第13、15、17天给予CRD 测试(CRD4、CRD5、CRD6),其中 Z+A、S+A 组在第 13、14、15、16、17 天给予电针干预(双侧后三里、上巨虚穴位,1mA,2/1511z,每天1次,每次30分钟)。第17天CRD测试完毕,取出各组小鼠L5-S2左侧脊神经节,每次CRD测试均对小鼠腹肌收缩程度进行AWR评分,以检测电针干预后小鼠直结肠高敏感变化状况。第二部分:第一部分干预完成的各组小鼠取出L5-S2左侧脊神经节,对脊神经节进行高通量基因测序,根据基因表达量分析、差异表达分析筛选出电针缓解小鼠直结肠高敏感的相关基因,基于基因本体(GO)数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路数据库对筛选出的基因进行富集分析,筛选出显著富集的功能和代谢通路;最后进行基因共表达网络分析,筛选出其中调控能力较强的基因,并对其进行功能或代谢通路注释分析。研究结果1、电针缓解小鼠直结肠高敏感症状行为学测试通过AWR评分记录的CRD诱发的腹肌收缩显示:CRD3时高敏感模型组、高敏感模型电针组小鼠在60mmHg压力时腹肌收缩记录的评分值高于其对应CRDO 60mmHg压力下评分值150%,确定高敏感模型组、高敏感模型电针组直结肠高敏感的形成;第三次电针干预后,CRD5诱发的腹肌收缩AWR评分结果显示Z+A组呈下降的趋势,第五次电针干预后,CRD6诱发的腹肌收缩AWR评分结果显示:腹肌收缩由大到小的顺序为:Z+C组>Z+A组>S+A、S+C组,其中Z+C组AWR评分显著高于Z+A、S+C组(P<0.05),Z+A组与S+C组、S+A组比较无统计学差异,表明电针有效抑制了酵母聚糖诱导的小鼠直结肠高敏感。2、电针能够逆转高敏感模型小鼠脊神经节神经元下调的基因将不同组间差异基因通过维恩图交集筛选出Car3、Hp、Gm29216等56个目的基因,表达趋势均为:56个基因在高敏感模型组的表达较盐水对照组表达下调(P<0.05),在高敏感模型电针组上的表达较高敏感模型组表达上调(P<0.05)、盐水对照组与盐水电针组上的表达比较无统计学差异(P>0.05),高敏感模型电针组与盐水对照组上的表达比较无统计学差异(P>0.05)。3、56个基因差异表达分析基于cuffdiff数据处理方法得出的56个差异基因在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组上的表达,盐水对照组与高敏感模型组相比差异最明显的前24个基因(P=5×10-5)中有23个基因同时也是高敏感模型组、高敏感模型电针组之间差异显著性排名靠前的基因(P=5X 10-5),即这 23 个基因(Car3、Hp、Gm29216、Hist2h2c、Thbs1、Elane、Klf2、Pglyrpl、Anxal、Ly6c2等)在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组三组上的表达变化趋势最明显,其中Car3、Hp、Gm29216、Hist2h2ac 4个基因在各组的表达量显著高于其它基因。4、56个基因GO富集分析GO注释的term条目共290条,其中显著富集的前20条分别为:免疫反应正调控、腺苷酸环化酶活化、细胞表面受体信号通路、转化生长因子β受体正调控、cGMP负调控信号通路、蛋白磷酸化、炎症反应、p38MAPK通路正调控、cAMP生物合成过程、电刺激反应;磷脂酰丝氨酸、磷酸脂酶A2抑制剂活化、腺苷酸环化酶结合活性、cAMP结合蛋白活性、钙离子依赖型蛋白激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶等;对应的差异基因主要包括:TThbsl(6 次)、Adcy4(3 次)、Anxal(3 次)、Mapkapk3(3 次)、Adrb2(2 次)、Ctsg(2 次)、Elane(2 次)、Xdh(2 次)等。5、56个基因KEGG代谢通路分析根据KEGG注释,56个基因显著定位到20个具体的代谢途径分支,分别为钙离子信号通道、胰岛素分泌、cGMP依耐型蛋白激酶、p53信号通路、脂类代谢、消化道腺体分泌、细胞凋亡、甲状腺激素合成、心肌细胞肾上腺素能信号通路、免疫正调控等;对应的差异基因主要包括:Adcy4(11 次)、Plcb2(9 次)、Adrb2(6 次)、Casp8(3 次)、H2-Q6(2 次)、Thbsl(2 次)、Hk2(2 次)等。6、56个基因共表达网络分析结果表明 Ly6c2、Lrmp、Plcb2、Anxal、Pglyrp1、Ncf4、Sik1、Elf4、Alox5、St k17b、Slc16a10、Fcnb、Vsir、Rin3等共15个基因的调控基因数均超过5个,其中F630028010Rik无显著富集的功能或通路,其余基因主要富集在细胞膜、细胞质囊泡、内质网组织、细胞内外信号转导、蛋白磷酸化、磷酸脂酶A2负调控、钙离子信号通道以及脂类代谢等功能上。研究结论本实验在慢性直结肠高敏感小鼠模型上,实施直结肠球囊扩张刺激、电针治疗,并用腹壁回撤反射评分评估,观察和分析了电针刺激后三里、上巨虚穴位对直结肠高敏感小鼠内脏痛感觉和痛行为的影响,并基于TRPV1探讨分析电针对直结肠高敏感模型小鼠脊神经神经元上基因的调控作用,结果表明:1、电针作用于后三里、上巨虚穴位能明显缓解酵母聚糖诱导的小鼠直结肠高敏感症状,且疗效与电针干预的频次呈正相关。2、电针缓解小鼠高敏感症状与上调高敏感模型小鼠脊神经节神经元中低表达的56个基因有关;56个差异基因显著富集在与TRPV1通道功能的发挥密切相关的组织结构(细胞膜、膜表面受体、细胞质囊泡等)及生物活性物质(蛋白质、脂质代谢中间产物、细胞内外信号转导通路)上;56个基因中Car3、Gm29216、Hist2h2ac、Hp 4个基因在各组的表达值显著高于其它基因;Ly6c2、F630028010Ri.k、Anxal、Pglyrp1、sik1 5个基因在盐水对照组、高敏感模型组、高敏感模型电针组之间变化趋势最明显,同时也是56个基因共表达网络调控中调控能力排名前8的基因,其显著富集功能或通路与TRPV1通道的合成及转运密切相关;56个基因GO、KEGG显著富集的功能及代谢通路所对应的基因中Adcy4、Plcb2、Adrb2、Thbs1出现的频次最高。3、电针治疗通过干预Adcy4、Adrb2、Plcb2等基因以及cAMP-PKA(cGMP-PKG)这条代谢通路来调控TRPV1的功能,达到缓解小鼠直结肠高敏感的效应。