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目的： 在我国城市化发展和老龄化进程逐步推进的大背景之下，心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)的患病率呈现不断升高的趋势，已成为全球十大死因之首。近年来研究表明，膳食结构的改变，包括饮酒行为的改变，是导致心血管疾病高发的重要原因之一，除了高脂高糖饮食在心血管疾病发生发展中的地位和作用外，长期过量的酒精摄入与心血管疾病也密切相关。目前无论在世界范围还是在我国，非合理化饮酒已成为突出的社会问题，且短期内难以克服，由此引发的酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)占总的心肌病病例的23％～40％，其主要病理特点为心肌肥大、心肌收缩功能障碍等。 与此同时，饮酒与心肌胰岛素抵抗和酒精性心肌病的相关性也愈发受到相关学者的关注，研究指出，胰岛素抵抗与早期心功能障碍明显相关，检查胰岛素敏感性可以作为一项筛查指标。目前关于乙醇与心肌胰岛素敏感性及相关通路应答方面的作用机制仍不清楚，本课题旨在探讨mTOR信号通路在饮酒所致的心肌胰岛素抵抗中的作用机制，为心肌胰岛素抵抗的防治提供理论依据。 方法： 1.细胞培养及处理:H9c2大鼠心肌细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，同时添加1％青霉素-链霉素，在37℃培养箱内贴壁培养。乙醇刺激组细胞给予100mM浓度的乙醇处理24小时后，进行后续实验。 2.采用MTT法检测乙醇处理对于H9c2细胞相对活力的影响;采用2-NBDG摄取实验检测H9c2心肌细胞的葡萄糖摄取能力，荧光显微镜下观察荧光信号强弱，并通过流式细胞仪定量检测各组荧光强度差异;采用Western blot检测不同处理下IRS-1丝氨酸位点的磷酸化水平。 3.采用实时荧光定量PCR和Western blot检测mTOR信号通路上游分子Rictor、Rheb及下游分子S6k2的表达水平。 4.采用慢病毒介导的RNAi在基因水平上沉默S6K2表达，并通过葡萄糖氧化酶法检测S6k2沉默对于H9c2心肌细胞葡萄糖摄取能力的影响，通过Western blot检测IRS-1丝氨酸位点磷酸化水平。 结果： 1.不同浓度乙醇对H9c2心肌细胞活性影响 以不同浓度的乙醇处理H9c2心肌细胞24h后通过MTT实验发现，与对照组相比，50mM和100mM浓度的乙醇对H9c2心肌细胞的相对活性无明显抑制;而200mM，400mM和800mM浓度的乙醇对H9c2心肌细胞进行刺激后，细胞相对活性分别降低了33.1％(P＜0.01)、63.2％(P＜0.01)和75.7％(P＜0.01)。 2.乙醇刺激减少H9c2心肌细胞的葡萄糖摄取，增加p-IRS-1(Ser307)表达水平 采用2-NBDG摄取实验，并用荧光显微镜进行观察，在乙醇刺激后的心肌细胞中发现荧光强度相较未加乙醇刺激组弱。进行平均荧光强度的定量分析后发现，未加乙醇刺激组的平均荧光强度相较乙醇刺激组高46.5％(P＜0.05)。Western blot结果显示，与未加乙醇刺激的对照组相比，乙醇刺激后p-IRS-1(Ser307)水平增加了14.4％(P＜0.05)。 3.乙醇刺激上调mTOR信号通路Rictor、Rheb、S6k2水平 RT-PCR结果显示，与对照组相比，乙醇刺激组Rictor、Rheb、S6k2的mRNA表达水平均有明显增加，分别增加了42.4％(P＜0.05)，49.5％(P＜0.05)，16.8％(P＜0.01)。Western blot结果显示，乙醇刺激使得Rictor、Rheb、S6k2的蛋白表达水平显著上调，分别上调23.2％(P＜0.05)，20.4％(P＜0.05)，23.5％(P＜0.05)。 4.S6k2沉默抑制乙醇诱导的葡萄糖摄取减少及p-IRS-1(Ser307)表达上调 在对H9c2心肌细胞进行了慢病毒介导的RNA干预后，发现LV-CON组细胞在乙醇刺激后葡萄糖摄取量下降了8.08％(P＜0.05)。LV-S6k2-RNAi组细胞在乙醇刺激后，葡萄糖摄取量与未加乙醇相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。Western blot结果显示，LV-S6k2-RNAi组与LV-CON组相比，p-IRS-1(Ser307)的蛋白表达量下降了33.2％(P＜0.05);在对H9c2心肌细胞进行S6k2沉默后，再进行100mM的乙醇刺激24h，p-IRS-1(Ser307)的蛋白表达量与未进行乙醇刺激相比，略有提高，但无统计学意义(P＞0.05)。 结论： 1.高剂量乙醇刺激降低心肌细胞相对活性。 2.乙醇刺激降低心肌细胞葡萄糖摄取能力，诱导胰岛素抵抗的发生。 3.乙醇刺激后心肌细胞mTOR信号通路上游分子Rictor、Rheb和下游分子S6k2表达上调。 4.S6k2沉默改善乙醇诱导的葡萄糖代谢障碍及心肌胰岛素抵抗。