结核病(tuberculosis，TB)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种以肺结核最为常见的慢性传染病。近年来，全球结核病疫情回升，结核病依然是一个全球性的、严重的、需要高度重视的公共卫生问题和社会问题。 化疗是治疗结核病人、控制和消灭传染源的最主要手段。但由于耐药结核菌，特别是多重耐药结核菌的增加，严重影响了结核病的化疗效果，给结核病控制带来了极大的困难，故药敏试验也变得更为需要。传统的药敏试验所需时间长，使耐药菌在局部扩散，加之痰培养的阳性率较低，在临床上很难常规应用。因此，结核分支杆菌耐药性的快速检测对结核病的早期有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。近年随着分子生物学的发展，用基因技术对结核菌进行诊断和药敏试验，开辟了新途径，并取得了可喜成绩。用于结核杆菌耐药基因检测的技术很多，相比之下，单链构象多态性分析(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)不失为一种较好的方法。SSCP可检测耐药基因点突变和短序列的缺失、插入，不需特殊仪器，具有 第四军医大学可士学位论文快速、操作简便、费用低，敏感和特异性均高的忧点。 异烟姘门s。niAf此IN H ）是治疗结核病的主要一线药物之一，故结核分支杆菌对异烟肘耐药的问题备受关注。揭示结核杆菌耐异烟肘的机制，建立一种对临床分离株乃至临床标本进行快速检测耐药的手段，是临床迫切需要解抉的问题。目前虽有PCR－SSCP检测耐异烟朕基回的报道，但不能一次检出多数量的耐药基因，从而使目前标准的化疗方案治疗夫败。为此，本课题的主要研究内容为：在进行结核杆菌标准株和临床分离株培养和药敏试验的基础上，建立一种对与耐异烟朕密切相关的p hC启动子、nln、［凯G基回新的分于药敏试验方法，即多重PCR－SSCP检测方法，并与测序结果相比较，参照药敏结果，探讨该方法的实用性和可行性。一、multiPCR方法的建2 已证实，编码过氧化氢－过氧化物酶的katG基因突变，是导致结核分支杆菌耐异烟朕的主要原因，但又不能完全解释这一现象。近年研究表明，inhA和 aphC启动于基因突变都与结核菌耐异烟姘有关，且这三个基因突变己被证实在幻％以上的结核菌耐异烟肘突变。为此，本研究使用Primerior nay公司的多重引物设计软件，成功的设计了aphC启动于、inhA、katG这弓个基因的6条引物，对所选基回通过合理选择扩增区域及长度，尽可能多的涵盖耐药基回突变位点，以期一次扩增出幻％以上的结核分支杆菌耐异烟盼基回。引物序列为：aphC启动子基回特异性引物根据 Genbarili：UI 6243的序列自行设计，扩增片段为 311 hp，引物序列为：A。 5’－GGT G八 AGT GGT GAAGTA GTC G－3’A。5’－CTT GCG GCA CTG CT”G AAC－3’；inhA基回特异性引物根据GenbanLk：U02492白序歹自行 设计，扩增片崭为395hp，引物序歹u为：IS’－TCC八CA TCT CGG CGT ATT CG－3’I。5’－CGG CAG CCAGTC AGA CAG－3’；k；tG基回特异性引物根据 EMBL：X6808的序列 E门于设计，扩增片段为458hP，引物序列为：K。5’－CGG CGA TOA GCG T”TACAG－3’K；．5’－（：GT CCT TGG CGG TGT ATT－3’。首先 对结卞亥分支杆菌 －4－ 第四军医大学硕士学位论文H37RV标准株和 58株临床分离株进行增菌培养，分别提取基因组DNA，进行常规PCR扩增。然后对multiPCR反应体系各种反应条件进行优化，成功建立了m71h－＊CR扩增方法。对H37Rv标准株和临床分离株分别采用常规P＊R和 nutiPCR同时进行扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达 100％。二、单基因SSCP检测耐异烟朕基因突变 1．药敏试验：对SS株临床分离株进行培养并采用绝对浓度法中的间接法进行药敏试验，培养基中异烟盼的浓度 10mg／L和 ling／L分别为高度和低度耐药标准。在58株临床分离株中，药物敏感株23株，耐异烟姘分离株35株，其中高度耐异烟朕27株，低度耐异烟姘8株。 2，单基因SSCP法检测结核杆菌耐异烟姘相关基因突变：分别扩增结核分支杆菌 H打7Rv和 58株临床分离株的 phC启动子、inhA和 katG基因，并将扩增产物进行 SSCP电泳分析，快速、特异地检出 phC启动子序列突变发生率为17．1％旧心引、inhA序列突变发生率为川刀％门八引、ha旧序列突变发生率为65，7％（士y3引。 3．直接测序法①irect Sequencing，DS）检测结核杆菌耐异烟胁相关基因突变：将35株耐药临床株扩增产物切下进行胶口收、克隆、转化、提取质粒。厂COR酶切、然后进行测序分析。在三个耐药基因中检出印hC启动子序列突变发生率乃刀％门乃引、inhA序列突变发生率34．3％门工’3引、郎0序列夹变发生率68．6o（2／35）。 4．两种方法结果比较：除inhA基因两种方法的结果有一定差异外，其余两个基因SSCP与测序法的检出率十分相近。phC启动子?