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玉米是重要的粮食作物,种植面积和产量在我国均居第一,是我国主要的饲料和部分地区的主要粮食来源,目前已成为粮饲兼用的作物。近年来玉米的供应逐渐受到威胁,其产量受到来自各种环境因素及耕地面积减少的影响,提高玉米产量以满足人口增长需求仍然是当前玉米育种工作的重要目标。籽粒作为产量性状的主要器官,对其发育相关基因的挖掘及功能鉴定开展研究,对解析玉米产量性状形成的遗传机理,培育高产优质玉米品种具有重要意义。籽粒突变体是玉米产量性状遗传研究的基础,本研究通过EMS（甲基磺酸乙酯）诱变自交系RP125的花粉,筛选得到一份玉米籽粒顶部淀粉缺失的缺口突变体,暂命名为qk2（quekou-2）。对qk2农艺性状进行考察,对ZmQK2基因进行图位克隆和等位验证,并对相关生理生化指标进行测定,结合候选基因生物信息学分析,基因表达分析和亚细胞定位等对ZmQK2的生物学功能进行了初步解析。取得的研究成果如下:1、qk2表型特征:突变体的粒长、粒宽、穗重、轴重、百粒重、穗粒重以及穗长、穗粗、轴粗等性状均显著小于野生型;叶长、叶宽、叶面积以及株高、穗位高,节间长和野生型并无显著差异;qk2的籽粒在15 DAP（Day After Pollination）开始出现淀粉合成和积累缺陷,并随灌浆时间的增加缺口表型越来越明显。2、遗传分析:构建B73×qk2遗传群体,F1代果穗无缺口分离,F1自交果穗上出现缺口表型分离的籽粒,调查正常与缺口籽粒个数,统计分析发现正常与缺口的分离比符合3:1,表明该突变性状受隐性单基因控制。3、ZmQK2的精细定位:利用BSA定位策略,对B73×qk2的F2群体中20个隐性单株和20个正常单株进行混池,用200多对多态性SSR标记进行基因型分析,发现6号染色体上的SSR标记bnlg2231与突变表型共分离,初步确定突变基因位于第6号染色体上。随后又开发了10个多态性In Dels标记,利用742个隐性单株的基因型数据计算遗传交换率,最终将候选基因精细定位在indel-9和indel-10之间,物理距离为6.7 Kb,该区段内只有1个开放阅读框,注释基因编码己糖激酶7（Hexokinase7,HXK7）,基因全长3,032 bp,共7个外显子,编码459个氨基酸。4、ZmQK2的克隆及等位验证:利用HXK7基因序列分段设计全长序列的扩增引物,分别对突变体和野生型的基因组进行克隆,测序结果显示在此基因的第5个外显子上存在一个由G到A的碱基突变,突变导致编码的氨基酸由甘氨酸（G）突变为了谷氨酸（E）;结合定位群体中全部隐性单株混池测序,发现该位点突变为纯合突变,初步将其确定为候选基因;另外,对突变体库中的另1份类似表型材料qk2-1进行测序,发现qk2-1在HXK7基因的第5个外显子上存在一个由G到A的碱基突变,编码氨基酸由甘氨酸（G）突变为了天冬氨酸（D）,上述结果表明ZmQK2编码的HXK7就是控制缺口表型的基因。5、生理生化指标测定:在成熟籽粒中qk2的可溶性糖含量较野生型略有升高;突变体和野生型材料授粉后不同时间点籽粒HXK7酶量变化不大,但突变体中HXK7酶活下降明显,在6 DAP和12 DAP的籽粒中与野生型相比存在显著性差异,在8 DAP,15 DAP,20 DAP的籽粒中存在极显著差异。6、ZmQK2的生物信息学分析:系统进化树分析表明与ZmQK2同源性最高的是高粱中的Sb HXK7（SORBI＿3009G069800）基因,此基因功能未知;motif保守性分析结果显示,ZmQK2基因在不同物种上都具有三个保守motif,qk2及qk2-1的突变位点均位于motif 2中;且qk2以及qk2-1中的甘氨酸在不同物种中均处在高度保守的状态,但是此位点的突变并没有引起蛋白质三维构象的变化。7、组织表达特性:ZmQK2在不同组织以及不同时期籽粒中均有表达,并且在8 DAP的籽粒中表达量最高。此外,对玉米HXK家族的另外8个同源基因进行表达分析,结果表明:ZmHXK4、ZmHXK5、ZmHXK7、ZmHXK8、ZmHXK10的表达与ZmQK2类似,主要集中在授粉结束后到籽粒灌浆前的时间段,即籽粒发育的早期;ZmHXK6的表达主要集中在籽粒灌浆期;而ZmHXK3a、ZmHXK3b在籽粒发育的早期和灌浆期均有高表达的情况。说明HXK家族基因在玉米籽粒发育及产量形成过程中具有重要作用。8、ZmQK2的亚细胞定位:设计带有EcoRI酶切位点的引物扩增ZmQK2基因最长转录本,利用同源重组酶将转录本与pM999-35S:EGFP载体连接,构建重组质粒,并将其转入玉米原生质体,进行亚细胞定位实验,激光共聚焦显微观察表明ZmQK2定位于细胞质中。9、突变导致qk2对外界糖信号感知减弱:将qk2和RP125萌发的种子放置在含有不同浓度葡萄糖的MS培养基上,待发芽后在黑暗条件下培养7 d并对幼苗生长情况进行观察,结果发现当葡萄糖浓度低于4%时幼苗胚轴生长没有明显差异,但在4%的葡萄糖浓度下野生型幼苗胚轴生长受抑制的程度要显著高于突变体,到葡萄糖浓度为5%-6%时表现为极显著差异,说明ZmQK2的突变降低了qk2对外界糖的感知。10、ZmQK2调控籽粒灌浆的可能机制:进一步分析发现突变位点处编码的氨基酸残基是豆蔻酰化修饰的靶点,突变导致HXK7豆蔻酰化位点丧失,该位点的缺失可能影响了HXK7蛋白的豆蔻酰化修饰过程,进而影响其正常的生理功能;同时突变体12 DAP籽粒中超氧化物歧化酶活力明显升高,推测ZmQK2基因的突变可能会对籽粒细胞活性氧清除过程产生影响,导致胚乳细胞提前凋亡,影响灌浆并最终导致qk2的表型。但相关调控机制还需进一步开展研究。