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研究背景肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种恶性度非常高的实体肿瘤,侵袭转移是其恶化发展的重要生物学特征,也是导致肝癌患者死亡的最主要原因。肿瘤细胞的侵袭转移是一个复杂的多种因素、多机制参与的共同调控进程,现已证实上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是影响肝癌细胞侵袭转移进程的重要分子机制之一。端粒酶作为影响肝癌发展进程的关键性机制酶,它的活性直接受端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,h TERT)调控,h TERT作为维持端粒结构及功能的关键性分子,最近研究发现其与肿瘤细胞EMT的发展进程密切相关。二十碳五烯酸(EPA)是n-3多不饱和脂肪酸的一员,前期研究发现其能够抑制多种恶性肿瘤的进展,但现今对其抗癌效用的作用机制还不明确,尤其是EPA对肝癌细胞侵袭转移能力的影响目前还未见报道。研究目的1.明确EPA对SMMC-7721肝癌细胞增殖及凋亡的影响;2.EPA能否逆转TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞EMT;3.EPA能否影响EMT介导的SMMC-7721肝癌细胞的侵袭转移;4.探讨h TERT在EPA影响EMT进程中的作用。第一部分EPA对SMMC-7721肝癌细胞增殖及凋亡的影响不同浓度EPA(0、25、50、100、200、300、400μM)与TGF-β1(10 ng/ml)共同干预人肝癌SMMC-7721细胞,检测SMMC-7721肝癌细胞增殖与凋亡变化。研究方法1.倒置显微镜下观察SMMC-7721肝癌细胞生长;2.MTT检测SMMC-7721肝癌细胞增殖率;3.流式细胞术检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡;4.Western检测SMMC-7721肝癌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达。实验结果1.显微镜下初步观察到EPA对SMMC-7721肝癌细胞具有生长抑制效果;2.MTT检测结果证实EPA干预后SMMC-7721肝癌细胞增殖率逐渐降低,且呈现出时间浓度依赖性;3.流式细胞术检测结果显示EPA干预48 h后SMMC-7721肝癌细胞出现凋亡,且凋亡率与EPA浓度呈正相关;4.Western结果表明EPA干预48 h后SMMC-7721肝癌细胞促凋亡蛋白Bax表达上调而能够下调抗凋亡Bcl-2蛋白的表达。结论EPA能够抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖并促使其凋亡,且抑制效果具有时间浓度依赖性。第二部分EPA对TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞侵袭转移能力的影响10 ng/ml TGF-β1刺激SMMC-7721肝癌细胞,诱导SMMC-7721肝癌细胞发生EMT。用50μM、200μM EPA干预TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞检测其侵袭转移能力的变化。研究方法1.倒置显微镜下观察人肝癌SMMC-7721细胞形态的改变;2.Western检测SMMC-7721肝癌细胞E-cadherin、N-cadherin蛋白表达;3.划痕实验检测SMMC-7721肝癌细胞迁移率;4.Transwell检测SMMC-7721肝癌细胞侵袭率;5.ELISA检测SMMC-7721肝癌细胞MMP-2、MMP-9表达。实验结果1.显微镜下初步观察到EPA能够抑制TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞EMT;2.Western结果验证了EPA能够逆转TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞EMT;3.划痕实验证实EPA能够明显降低TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞的迁移能力,且抑制效果存在时间浓度依赖;4.Transwell实验证实EPA能够明显降低TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞的侵袭能力,且抑制效果也存在时间浓度依赖;5.ELISA检测结果表明EPA能够抑制TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞分泌基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9。结论10 ng/ml TGF-β1能够诱导SMMC-7721肝癌细胞发生EMT。EPA可以逆转TGF-β1介导的EMT,并抑制SMMC-7721肝癌细胞MMP-2和MMP-9的分泌从而降低其侵袭转移能力。第三部分EPA对TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞端粒酶活性的影响50μM、200μM EPA作用于TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞,检测SMMC-7721肝癌细胞端粒酶的活性及端粒酶调控蛋白h TERT的表达。研究方法1.ELISA检测人肝癌SMMC-7721细胞端粒酶活性;2.Western检测SMMC-7721肝癌细胞h TERT蛋白表达;3.Real-time PCR检测SMMC-7721肝癌细胞h TERT m RNA表达;4.细胞免疫荧光法观察SMMC-7721肝癌细胞h TERT荧光强度。实验结果1.EPA能够抑制TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞的端粒酶活性,且抑制效果具有时间浓度依赖性;2.EPA能够明显降低TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞h TERT蛋白表达;3.EPA能够明显降低TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞h TERT m RNA表达;4.细胞免疫荧光结果显示EPA能够降低TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞h TERT荧光强度。结论EPA能够抑制TGF-β1诱导的SMMC-7721肝癌细胞hTERT蛋白及其mRNA的表达,进而降低SMMC-7721肝癌细胞侵袭转移。h TERT可能是EPA发挥其抗癌效用并抑制肝癌细胞侵袭转移的关键作用靶点。