研究背景和目的基因CCDC170/C6ORF 97(简写为CCDC170)位于6号染色体长臂6q25.1区域,与雌激素受体α(ESR1)临近,是ESRl上游的开放读码框。近来,已证明CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座是参与遗传性及散发性乳腺癌进展的理想候选基因,CCDC170/C6ORF97与乳腺癌易感性有明确的相关性。近来的全基因组关联分析(GWAS)提示,CCDC170/C6ORF97-ESR1基因座(6q25.1)上的12个变异与乳腺癌和骨质疏松症的风险相关。研究者识别了位于CCDC170/C6ORF97-ESR1基因间区域的乳腺癌风险相关的单核苷酸多态性(SNP)rs2046210。许多相关研究已开始探讨不同人群中这个GWAS基因座与乳腺癌风险的关系。人们发现,相对于雌激素受体阳性乳腺肿瘤,rs2046210在雌激素受体阴性乳腺肿瘤中有更强的风险相关性,提示这个风险变异很可能不依赖于ESR1。相关研究已报道了散发性乳腺癌及其他癌症中的CCDC170无义突变(如p E48和p Q405)。近来有研究报道,通过高通量的转录组测序,发现了从ESR1第二个非编码外显子到CCDC170第六个和/或第七个外显子的肿瘤特异性基因重排。进一步研究表明,氨基末端(N末端)截短的CCDC170蛋白(p.593-715)是由这个ESR1-CCDC170基因座重排所致。这个截短蛋白的表达增加了乳腺癌细胞的运动性并增强了正常肌上皮细胞的转化。大量的研究表明,CCDC170蛋白的各种变异在乳腺癌发生、发展中有重要作用。因此,很有必要对这个未知基因的特征及功能进行深入研究。但至今为止,全长CCDC170蛋白及其突变蛋白的亚细胞定位、在乳腺癌发生发展中的功能尚未见报道。本研究拟首次研究全长CCDC170蛋白及其突变蛋白的亚细胞定位,并探讨其在乳腺癌发生发展中的作用及作用机制。第一部分CCDC170及其突变蛋白的亚细胞定位研究目的观察全长CCDC170蛋白及其突变蛋白在肿瘤细胞内的亚细胞定位,并探讨其细胞内定位的可能机制。材料与方法1.应用分子克隆技术,构建携带GFP、CCDC170基因及其截短突变体的重组质粒:Tight质粒(TRE-Tight-GFP、TRE-Tight-GFP-CCDC170、TRE-Tight-GFP-Q405、TRE-Tight-GFP-E48、TRE-Tight-GFP-p.593-715)、非Tight质粒(p CMV6-GFP-p.593-715)。用于后续实验研究。2应用定点诱变技术,构建携带CCDC170基因第1810位及第2047位核苷酸点突变的重组质粒:Tight质粒和非Tight质粒。用于后续实验研究。3.将构建的质粒转染MCF7-tet-on细胞,以western blotting方法检测全长CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白的表达,验证质粒构建准确无误。4.将构建的质粒转染MCF7-tet-on细胞及Hela细胞,以GFP抗体、RCAS1抗体行免疫荧光实验,荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下拍照,观察全长CCDC170蛋白及截短CCDC170蛋白在MCF7-tet-on细胞及Hela细胞内的亚细胞定位。结果1.CCDC170基因重组质粒的蛋白表达验证的结果显示,将构建的质粒转染MCF7-tet-on细胞,以GFP抗体、CCDC170抗体行western blotting分析,可见“GFP-CCDC170”融合蛋白或“GFP-截短CCDC170”融合蛋白的准确表达。2.CCDC170在MCF7-tet-on细胞内定位的研究结果显示,全长CCDC170蛋白定位于高尔基体,其1810位核苷酸及2047位核苷酸点突变的突变蛋白亦定位于高尔基体,与全长CCDC170蛋白无明显差别。其截短突变蛋白p Q405则定位于细胞浆。3.CCDC170及其截短CCDC170蛋白在Hela细胞内定位的研究结果显示,全长CCDC170蛋白定位于高尔基体,“GFP-截短CCDC170”融合蛋白的亚细胞定位是:GFP-p Q649定位于细胞核周边,GFP-p Q405、GFP-p V264定位于细胞浆,GFP-p E48、GFP-p.593-715定位于全细胞。截短CCDC170蛋白可导致野生型CCDC170失去正常的亚细胞定位。4.CCDC170通过羧基末端(C末端)附着于高尔基体表面,在CCDC170的C末端,有2个序列(以区域a和b表示)可能对CCDC170的高尔基体定位有重要作用。直接的C末端(区域b)是特定的高尔基体附着所必需的,但这对高尔基体的定位尚不足够,通过直接C末端(区域b)的附着可能需要第二序列(区域a)。第二部分CCDC170在乳腺癌发生发展中的作用及作用机制目的观察CCDC170对乳腺癌细胞增殖、移动能力的影响,观察CCDC170与相关肿瘤分子标记物的表达、微管蛋白乙酰化的关系,检测CCDC170在乳腺癌细胞的基础表达及其对细胞增殖能力的影响,探讨CCDC170在乳腺癌发生发展中的作用及作用机制。材料与方法1.以携带野生型CCDC170及其截短基因的质粒转染MCF-tet-on细胞,应用免疫荧光技术,检测GFP阳性的MCF7-tet-on细胞中Ki-67阳性细胞的比例。2.以携带野生型CCDC170及其截短基因的质粒转染MCF7-tet-on细胞,通过软琼脂细胞集落形成实验,观察细胞集落形成数目,检测转染相关质粒的MCF7-tet-on细胞的增殖、移动能力。3.以携带野生型CCDC170及其截短基因的质粒转染MCF7-tet-on细胞,应用Western blotting技术,观察CCDC170与p53、裂解PARP-1、EGFR、Gab1、p STAT3、AKT、p AKT等肿瘤分子标记物表达的关系。4.以CCDC170 Si RNA转染MCF7-tet-on细胞,行CCDC170基因敲低,并以CCDC170基因敲低的MCF7-tet-on细胞行细胞划痕实验,观察CCDC170在乳腺癌细胞中的基础表达及其对细胞增殖的影响。5.应用免疫荧光技术,观察野生型CCDC170及其截短蛋白对肿瘤细胞微管蛋白乙酰化的影响。结果1.免疫荧光结果显示,在GFP阳性表达的MCF-7-tet-on细胞中,p CMV6-GFP、p CMV6-GFP-CCDC170、p CMV6-GFP-Q405三组中Ki-67阳性细胞的百分比分别为67%、44%、48%。p CMV6-GFP-CCDC170及p CMV6-GFP-Q405组的Ki-67阳性细胞百分比明显低于p CMV6-GFP组(P<0.05),p CMV6-GFP-CCDC170与p CMV6-GFP-Q405组相比则无明显差异(P>0.05)。2.免疫荧光结果显示,在GFP高表达的MCF-7-tet-on细胞中,p CMV6-GFP、p CMV6-GFP-CCDC170、p CMV6-GFP-p.593-715三组中Ki-67阳性细胞的百分比分别为57%、32%、71%,p CMV6-GFP-CCDC170组的Ki-67阳性细胞百分比明显低于p CMV6-GFP组(P<0.001),p CMV6-GFP-p.593-715组的Ki-67阳性细胞百分比明显高于p CMV6-GFP组(P<0.05)。而在GFP低表达的MCF-7-tet-on细胞中,p CMV6-GFP-CCDC170组的Ki-67阳性细胞百分比明显低于p CMV6-GFP组(P<0.05),p CMV6-GFP-p.593-715组的Ki-67阳性细胞百分比与p CMV6-GFP组相比无明显差异(P>0.05)。3.软琼胶细胞集落形成实验结果显示,p CMV6-GFP-CCDC170、p CMV6-GFP-Q405组形成的细胞集落数目少于p CMV6-GFP组,而p CMV6-GFPp.593-715组形成的细胞集落数目多于p CMV6-GFP组,p CMV6-GFP-CCDC170与p CMV6-GFP-Q405组形成的细胞集落数目相仿。4.Western blotting结果显示,p CMV6-GFP-CCDC170组裂解PARP-1的表达强度高于p CMV6-GFP-p.593-715组及p CMV6-GFP组(对照);至于p53、EGFR、Gab1、p STAT3、AKT、p AKT的表达强度,p CMV6-GFP-CCDC170组与p CMV6-GFP-p.593-715组及p CMV6-GFP组相比,无明显差异。5.CCDC170敲低及细胞划痕实验结果显示,随着细胞划痕愈合时间的推移,对照si RNA组的细胞缺损区域明显减小,si RNA A、si RNA C组的细胞缺损区域亦有所减小,但减少程度较弱。24、48、72、96小时对照si RNA组的细胞划痕愈合率分别为17.80%、34.68%、48.71%、61.35%,si RNA A组为7.23%、16.98%、26.37%、38.90%,si RNA C组为14.25%、24.25%、31.61%、43.21%,si RNA A、si RNA C组的细胞划痕愈合速度明显慢于对照si RNA组。6.免疫荧光结果显示,p CMV6-GFP、p CMV6-GFP-CCDC170、p CMV6-GFP-Q405、p CMV6-GFP-p.593-715转染的hela细胞中均有强度不等的乙酰化微管蛋白表达(红色荧光)。计算红色荧光的校正总细胞荧光(CTCF),可见p CMV6-GFP-CCDC170组的CTCF值最高,p CMV6-GFP-Q405组次之,p CMV6-GFP组及p CMV6-GFP-p.593-715组最低。p CMV6-GFP-CCDC170组、p CMV6-GFP-Q405组的CTCF值显著大于p CMV6-GFP组(P<0.05),而p CMV6-GFP-p.593-715组的CTCF值与p CMV6-GFP组相比无明显差异(P>0.05)。结论1.野生型CCDC170蛋白定位于肿瘤细胞的高尔基体,是定位于高尔基体的卷曲螺旋蛋白家族成员。截短CCDC170蛋白可导致野生型CCDC170失去正常的亚细胞定位。2.CCDC170通过C末端附着到高尔基体表面,在CCDC170的C末端,有两个特定序列可能对CCDC170在高尔基体的定位有影响。3.在调节乳腺癌细胞增殖、细胞运动性及细胞侵袭时,野生型CCDC170与截短CCDC170蛋白具有不同的作用。过表达的野生型CCDC170显著地抑制细胞的增殖及细胞移动、侵袭,p Q405亦抑制细胞的增殖,而p.593-715则促进细胞的增殖。4.野生型CCDC170及截短CCDC170蛋白在细胞内定位、功能上均存在差异,提示CCDC170的亚细胞定位和致瘤潜能之间有相关性,即通过基因突变,CCDC170蛋白在高尔基体正常定位的破坏可导致乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的变化,进而影响乳腺癌病情的进展。5.基础表达的野生型CCDC170促进乳腺癌细胞的增殖,过表达的野生型CCDC170则显著地抑制乳腺癌细胞的增殖。过表达的野生型CCDC170可能通过调节PARP-1的裂解促进乳腺癌细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖;亦可能通过促进微管蛋白乙酰化而抑制细胞增殖。野生型CCDC170及截短CCDC170蛋白对乳腺癌细胞增殖的不同影响可能与微管蛋白乙酰化有关。6.本研究首次阐述了新的乳腺癌相关蛋白CCDC170的亚细胞定位及功能,揭示了CCDC170在乳腺癌发生、发展中的作用及作用机制。填补了该研究领域的空白。以CCDC170相关通路异常作为研究目标,可能是乳腺癌治疗的新策略,将揭示乳腺癌靶向治疗的新途径,有望改善乳腺癌的治疗效果。