目的（1）用木犀草素（Luteolin,Lut）及叶酸（Folicacid,FA）干预经黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）染毒的人正常食管上皮细胞,观察其对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR）基因、叶酸受体 1（folate receptor 1/a,FOLR1/FRa）基因表达及MTHFR基因启动子区甲基化状态的影响,探索Lut及FA干预对AFBi毒性的保护作用及其机制,为Lut的临床应用及其与FA对预防、控制AFB1对人正常食管上皮细胞的毒性作用提供一定的实验基础和理论依据。（2）Lut干预食管癌Eca109细胞,探讨Lut诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用及其作用机制。方法（1）AFB1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:用Cell Counting Kit-8试剂盒（CCK-8）测定AFB1对人食管正常上皮细胞增殖的影响;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。（2）Lut及FA对AFB1染毒处理的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:用Lut及FA干预AFB1处理的人类正常食管上皮细胞,CCK8法检测细胞生长状况,FCM检测细胞周期变化及细胞凋亡情况。（3）Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:Real-time PCR检测MTHFR、FOLR1 mRNA的表达情况;Western blot检测MTHFR、FOLR1蛋白表达情况;MassArray甲基化定量检测细胞MTHFR基因启动子区甲基化水平。（4）Lut对人食管癌Eca109细胞生理学的影响及其作用机制的研究:四甲基氮唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）法检测Lut对Eca109细胞增殖的影响;FCM检测食管癌细胞周期和凋亡情况;Real-timePCR 检测食管癌 Eca109 细胞 CDK2、CyclinA、Caspase9 及 Caspase3mRNA 的表达情况;Western Blot检测食管癌Eca109细胞CDK2、CyclinA、Caspase9及Caspase3蛋白表达水平。结果1.AFB1染毒处理对人正常食管上皮细胞生理学的影响:（1）用13μM、25μM、50μM、100μM、200μMAFB1处理人类正常食管上皮细胞24h、48h、72h,均可以抑制细胞增殖;（2）FCM周期检测结果显示,AFB1主要作用于人正常食管细胞的G0/G1期及S期,50μM、100μM、200μM AFB1处理细胞24h,G0/G1期细胞比例明显升高（p<0.05）,S期细胞比例明显降低（p<0.05）,细胞被阻滞在G0/G1期;（3）100μM、200μMAFB1组细胞凋亡比例明显高于空白对照组（p<0.05）,50μMAFB1组早期凋亡细胞比例明显升高（p<0.05）。2.Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞的干预作用的研究:（1）Lut及Lut联用FA干预组细胞抑制率明显低于染毒对照组（p<0.05）,FA单独干预的效果不明显（P>0.05）;（2）Lut、Lut联合FA干预组G0/G1期细胞比例较染毒组明显降低（P<0.05）,S期的细胞所占比例明显高于染毒对照组（P<0.05）;FA干预效果不明显;（3）Lut、Lut联合FA干预组细胞凋亡率明显低于染毒对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Lut及FA对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1基因影响的研究:（1）Real-time PCR检测结果显示:AFB1染毒24h上调人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1mRNA的表达（P<0.05）。经Lut干预后,细胞MTHFR、FOLR1 mRNA的表达明显减少（P>0.05）。用20μM、200μMFA进行干预,细胞MTHFRmRNA的表达未受明显的影响（P>0.05）;而200μMFA组FOLR1 mRNA的表达明显下降（P<0.05）,20μM FA组下调效果不及200μM FA组（P<0.05）。Lut联用FA干预能明显减弱AFB1对MTHFRmRNA表达的上调影响（P<0.05）,Lut联用20μMFA组与Lut联用200μM FA组对经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞FOLR1 mRNA表达产生不同的调节作用（P<0.05）;（2）实验结果显示,AFB1染毒上调人正常食管上皮细胞MTHFR蛋白的表达（P<0.05）,下调FOLR1蛋白的表达（P<0.05）。经Lut干预后,细胞MTHFR蛋白表达减少、FOLR1蛋白表达增加（P<0.05）。20μM、2000μMFA干预组细胞MTHFR蛋白的表达程度与染毒组相近（P>0.05）;FOLR1蛋白表达程度接近空白对照组（P>0.05）,提示FA对MTHFR蛋白表达干预效果不明显,对FOLR1蛋白表达的干预效果明显。Lut联用FA干预能明显减弱AFB1对MTHFR、FOLR1蛋白表达的影响（P<0.05）。（3）MassArray甲基化定量检测细胞MTHFR扩增子中的CpG单位的甲基化水平,结果显示,CpG₅、CpG₆.7、CpG₁6、CpG₃5、CpG₄2单位的染毒组甲基化水平明显高于空白对照组（P<0.05）。比较CpG₅和CpG₃5位点的甲基化水平,发现Lut组及Lut联用200μM FA干预组的甲基化水平明显低于染毒组（P<0.05）,与空白对照组接近（P>0.05）;CpG₆.7位点,染毒组细胞甲基化水平明显高于空白对照组（P<0.05）,200μM FA组的甲基化水平明显低于染毒组（P<0.05）;CpG₁6、CpG₄2位点,除20μMFA干预组,其余各干预组干预效果明显（P<0.05）。4.Lut对人食管癌Eca109细胞生理学的影响及其作用机制的研究:（1）MTT实验结果表明,用Lut 浓度为 40μM、80μM、120μM、160μM、200μM、240μM 处理食管癌 Eca109 细胞 24h、48h 和72h,均可以抑制细胞增殖（P<0.05）,且随Lut浓度的增加,呈倒U型;（2）选用40μM、160μM、240μM为后期实验干预浓度,经FCM检测,Lut浓度为160μM、240μM时,细胞阻滞于S期间,并在浓度为160μM时诱导细胞凋亡,细胞早凋率明显增加（P<0.05）;（3）Lut可下调CDK2mRNA的表达（P<0.05）,且随着浓度的增加,Lut对CyclinA、Caspase9及Caspase3mRNA表达的作用呈现出先促进后抑制的趋势;（4）Lut可下调CDK2蛋白表达（P<0.05）,对CyclinA表达的作用表现为先促进后抑制,160μM、240μMLut组CyclinA蛋白表达受抑制（P<0.05）,蛋白表达水平随剂量的增加而降低。Lut对Caspase9、Caspase3表达呈现先增加后抑制的作用趋势,240μM Lut组Caspase9、Caspase3蛋白表达明显受抑制（P<0.05）。结论:（1）AFB1能够通过阻滞细胞周期,促进细胞凋亡,来抑制人正常食管上皮细胞增殖,并存在一定的剂量-效应关系,Lut和FA的干预能够减弱AFB1对人正常食管上皮细胞的增殖抑制、周期阻滞及凋亡促进作用,对AFB1的毒性作用起到一定的保护作用。（2）Lut和FA的干预可以减弱AFB1对人正常食管上皮细胞MTHFR、FOLR1mRNA和蛋白表达的影响,改善细胞FA代谢,从而发挥对人正常食管上皮细胞的保护作用;Lut及FA可以减弱AFB1对人正常食管上皮细胞的毒性作用,保护人正常食管上皮细胞。Lut及FA的干预可以降低MTHFR基因启动子区因AFB1所致的甲基化水平的升高,不同CpG位点干预效果不同。（3）Lut通过抑制食管癌Eca109细胞的增殖,下调Eca109细胞CDK2及Cyclin A将细胞周期阻滞于S期并诱导细胞凋亡,发挥抑制食管癌的作用;Lut诱导Eca109细胞凋亡,其作用机制涉及Caspase9、Caspase3的表达,但具体机制尚需进一步研究。