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食源性致病菌是指可以通过食物、粮食或其他介质致病的病原体,由食源性致病菌引起的食品安全事故在世界和中国屡见不鲜。致病菌检测的国标方法具有操作繁琐,耗时费力,灵敏度低等缺点。环介导等温扩增技术(LAMP)因其反应条件温和而备受研究人员的青睐,虽然LAMP技术在各个方面均有优势,但它仍然需要核酸提取、扩增与产物分析等,如何简化操作、提高系统集成度成为致病菌核酸现场快速检测的关键。为了解决这一问题,本文结合微流控芯片技术构建了一种集DNA提取和LAMP扩增于一体的纸基微芯片,并成功应用于模拟的真实样品中致病菌的检测,大大提高了检测效率。
首先,针对食源性致病菌引起的食品安全问题,概述了4种重要致病菌的特点及危害。全面论述了食源性致病菌快速检测技术的研究进展,分析了未来食源性致病菌检测技术的发展趋势,系统地阐述了LAMP技术的理论基础。
然后,在理论研究的基础上,本文构建了一种制作简单、成本低廉的纸基微芯片,对微芯片的材质选择、结构尺寸、温度控制系统、检测系统等进行了设计,并对微芯片的工作条件进行了优化。以大肠杆菌O157:H7为目标菌株,对微芯片的性能进行测试,结果表明DNA浓度的对数值和荧光强度值呈良好的线性关系(R2=0.9889),灵敏度为0.0134ng/uL,并可实现四种致病菌(大肠杆菌O157:H7,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌)的同时检测。证明微芯片具有灵敏度高、特异性强及高通量检测的性能。
最后,本文通过对微芯片进行改进,构建了集DNA提取和LAMP扩增于一体的纸基微芯片。以沙门氏菌为目标菌株,对模拟真实样品(加有沙门氏菌的牛奶)进行检测,结果表明细菌浓度的对数值和荧光强度值呈线性关系(R2=0.9896),最低检测浓度为12CFU/mL,从细菌的裂解到荧光检测,耗时约68min。最后用国标法和微芯片法检测同一批盲样,两种方法的检测结果一致,通过计算得出盲样浓度的理论值为5.1×103CFU/mL。
总之,本文基于LAMP技术构建了一种集DNA提取和LAMP扩增于一体的纸基微芯片,具有制作简单、成本低廉、检测快速、特异性强、灵敏度高及高通量检测的优点,未来有望形成高效的微生物即时检出专业仪器。
首先,针对食源性致病菌引起的食品安全问题,概述了4种重要致病菌的特点及危害。全面论述了食源性致病菌快速检测技术的研究进展,分析了未来食源性致病菌检测技术的发展趋势,系统地阐述了LAMP技术的理论基础。
然后,在理论研究的基础上,本文构建了一种制作简单、成本低廉的纸基微芯片,对微芯片的材质选择、结构尺寸、温度控制系统、检测系统等进行了设计,并对微芯片的工作条件进行了优化。以大肠杆菌O157:H7为目标菌株,对微芯片的性能进行测试,结果表明DNA浓度的对数值和荧光强度值呈良好的线性关系(R2=0.9889),灵敏度为0.0134ng/uL,并可实现四种致病菌(大肠杆菌O157:H7,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌)的同时检测。证明微芯片具有灵敏度高、特异性强及高通量检测的性能。
最后,本文通过对微芯片进行改进,构建了集DNA提取和LAMP扩增于一体的纸基微芯片。以沙门氏菌为目标菌株,对模拟真实样品(加有沙门氏菌的牛奶)进行检测,结果表明细菌浓度的对数值和荧光强度值呈线性关系(R2=0.9896),最低检测浓度为12CFU/mL,从细菌的裂解到荧光检测,耗时约68min。最后用国标法和微芯片法检测同一批盲样,两种方法的检测结果一致,通过计算得出盲样浓度的理论值为5.1×103CFU/mL。
总之,本文基于LAMP技术构建了一种集DNA提取和LAMP扩增于一体的纸基微芯片,具有制作简单、成本低廉、检测快速、特异性强、灵敏度高及高通量检测的优点,未来有望形成高效的微生物即时检出专业仪器。