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大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最为常见的两种细菌,脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和磷脂壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)分别是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的主要毒力成分,均能引起奶牛乳腺内的炎症反应。在健康奶牛的乳腺结构中,腺泡上皮细胞之间的紧密连接参与构成血乳屏障,防止牛奶成分通过乳腺腺泡与血清相互渗透。细菌引起的乳腺炎诱发血乳屏障发生损伤时,常伴随着奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epitheiali cells, BMECs)紧密连接的变化。本研究旨在通过RNA-seq分析分别用LPS和LTA侵染奶牛BMECs引起的转录组表达变化,并探究在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎血乳屏障损伤中差异表达的促炎性因子发挥的作用。 实验首先用LPS或LTA侵染奶牛乳腺上皮细胞建立体外的乳腺炎细胞模型,通过高通量测序 RNA-Seq 分析,筛选奶牛 BMECs 对这两种不同的毒力因子的差异表达mRNA。通过对差异表达基因进行分析确定在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎期间能够引起乳腺炎血乳屏障损伤的促炎因子。在这些差异表达基因中,LPS处理组中白介素1β(IL-1β)表达显著增高并且多个炎症相关的信号通路均富集了IL-1β,随后实验深入研究IL-1β在乳腺炎血乳屏障损伤过程中发挥的作用。实验进一步用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)验证IL-1β等促炎性因子的mRNA表达水平是否与测序结果相一致,并分别在患有乳腺炎和正常的乳腺组织中用qRT-PCR及酶联免疫吸附实验检测IL-1β在mRNA和蛋白水平上的表达和分泌水平,验证了IL-1β确实参与乳腺的炎症反应过程。随后,实验用外源性IL-1β处理BMECs来模拟炎症状态下增高的IL-1β对乳腺上皮细胞细胞紧密连接通透性的影响及作用机制。实验在细胞水平上用蛋白印迹(Western Blotting)和免疫荧光检测三种紧密连接蛋白ZO-1,occludin和claudin-1的表达,发现在IL-1β处理组的表达明显降低。通过跨上皮细胞电阻检测、中性粒细胞迁移实验和异硫氰酸荧光素FITC葡聚糖透过性实验检测等发现IL-1β处理可明显增强 BMECs 紧密连接通透性。在组织水平上,HE 染色、免疫荧光和电镜观察上皮细胞超微结构等发现IL-1β处理过的小鼠乳腺组织血乳屏障破坏,为探究该过程是否被肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)调节,用MLCK抑制剂ML-7预处理BMECs依次进行上述实验,发现ML-7预处理过的BMECs紧密连接恢复正常。实验进一步通过ERK1/2抑制剂处理上皮细胞,通过Western Blotting和qRT-PCR检测MLCK在蛋白和mRNA水平上的表达,发现IL-1β引起BMECs紧密连接的变化是通过IL-1β-ERK1/2-MLCK信号通路引起的。 上述结果表明LPS和LTA能够引起BMECs发生全基因组表达变化,IL-1β能够通过IL-1β-ERK1/2-MLCK信号通路对BMECs紧密连接及血乳屏障产生影响,这一结果为奶牛乳腺炎血乳屏障损伤的发生和奶牛乳腺炎的防治提供新的思路。