豪氏变形杆菌功能性蛋白探究及基因重组表达

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随着环境污染和能源短缺的加剧,开发清洁环境友好型的新能源是当务之急,豪氏变形杆菌(Proteushauseri)ZMd44作为一株新颖的产电菌,其能同步进行偶氮染料降解和生物产电,在未来环境保护和能源供给应用具有较大潜力。  本研究提出用微生物环境刺激的方式,系统研究金属离子、染料浓度及介质对豪氏变形杆菌降解染料速率的影响,实验结果表明添加5mM金属离子时,金属离子抑制偶氮染料降解速率顺序:Cu2+>Zn2+>Mn2+>Co2+>K+=Na+,其中Cu2+和Zn2+对偶氮染料降解有强烈的抑制作用,而K+和Na+基本无影响。豪氏变形杆菌对偶氮染料降解呈两级反应,不同浓度染料的比脱色速率拟合类米氏方程V=Vmax[Dye]/(Km+[Dye]),得到Vmax=93.6mg/L/h/g-DCW;Km=326mg/L。豪氏变形杆菌全细胞、胞内蛋白及胞外蛋白在以LB培养基为介质的脱色体系中偶氮染料的降解率超过90%,而在无菌水体系中偶氮染料无降解,培养基中酵母提取物和蛋白胨是重要的氧化还原介质。  本研究首次发现硫酸铜能诱导豪氏变形杆菌产生漆酶McoA-laccase,最佳诱导条件为在接种或对数生长期前期添加3mM的硫酸铜进行诱导。而且随着硫酸铜诱导浓度的增加,全细胞和胞内漆酶的酶活也递增,这可能是由于铜离子提高了豪氏变形杆菌的漆酶基因转录水平,同时利用生成的漆酶来提高其铜抗性。通过电子自旋共振分析漆酶McoA-laccase含有典型的T1和T2铜位点,其最佳反应温度和pH分别为60℃和2.2,分析表明此酶在温度低于50℃和微酸性环境下活性较为稳定。  应用一维蛋白电泳耦合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析鉴定豪氏变形杆菌在不添加或添加3mM硫酸铜培养时的全细胞和周质蛋白的差异蛋白,比较10条差异蛋白的信息,其中铜传输ATPase,磷酸烯醇式丙酮酸激酶,鞭毛蛋白和外膜蛋白是可能与铜平衡相关的蛋白。亚细胞蛋白质组学分析清晰地展现了在不同亚细胞组分(细胞质,周质和细胞碎片)与铜平衡相关蛋白在不同硫酸铜浓度(0-4mM)条件下蛋白表达量趋势,其变化趋势与实时荧光定量PCR的结果一致。与不添加硫酸铜相比,豪氏变形杆菌在含3mM硫酸铜的LB平板上生长时群集运动性大大减少,并且电子扫描显微镜观察到细菌分泌物在添加硫酸铜后也大量减少,这使得铜可以制成金属药物应用于变形杆菌感染的靶向治疗。本研究成功重组表达漆酶(多铜氧化酶)的基因lac2,经过硫酸铜和乳糖的双重诱导培养后才会大量表达有活性的漆酶。  本研究初步探讨豪氏变形杆菌的对偶氮染料降解的影响因素,重点研究了金属铜刺激下,微生物产酶及铜抗性机制,为豪氏变形杆菌在复杂环境中的应用提供指导意义,为进一步开发此菌的功能提供理论依据。
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