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背景心肌细胞发生缺血再灌注损伤(RI)时,细胞的钙调控发生改变,肌浆网的钙摄取功能和肌膜钙ATP酶受到抑制,钙离子在细胞内蓄积,形成钙超载;细胞内过多的钙离子可激活胞内的磷脂酶A2,使细胞膜磷脂分解,由黄嘌呤氧化酶途径生成大量的氧自由基,后者直接造成心肌细胞损伤,所以细胞内的钙超载和氧自由基产生增多是造成损伤的重要原因。心肌缺血再灌注损伤最常见的表现包括心肌酶谱的变化、各种心律失常和心肌顿抑。西医缺少积极的防治办法,中医治疗能起到一定的疗效。生脉散及其注射剂是临床广为应用的益气补阴固脱的方剂,其抗心肌缺血再灌注损伤(RI)的作用备受关注。超微饮片是近年来新研制的一种中药饮片,目前许多研究表明超微饮片不仅可以替代传统饮片用于临床,而且可以加速药物成分的吸收,减少药物的剂量。关于超微生脉散在抗心肌缺血再灌注损伤(RI)的作用目前缺少研究。目的1.通过对超微生脉散和普通生脉散抗心肌RI的对比研究,为超微饮片的进一步研究和开发应用提供理论依据。2.探索生脉散在抗RI过程中的抗细胞内钙超载作用的调控机制,研究超微生脉散和普通生脉散对心肌RI模型细胞内钙离子浓度的影响和对心肌细胞钙调节蛋白SERCA2、RYR2的mRNA表达的影响。方法1.用结扎30min/松开大鼠左冠状动脉前降支的方法造成再灌注损伤模型。在实验前60min,分别给予生理盐水和药物,分组为:正常组(C)、模型组(M),普通生脉散低剂量治疗组(T1)、普通生脉散中剂量治疗组(T2)、普通生脉散高剂量治疗组(T3)、超微生脉散低剂量治疗组(F1)、超微生脉散中剂量治疗组(F2)、超微生脉散高剂量治疗组(F3)。实验中观察心律失常的发生情况。再灌注180分钟后,取血分离血清,检测LDH、CK-MB、MDA、SOD。摘取心脏,免疫组化测Bax、Bcl-2和caspase-3的表达。2.培养SD乳鼠心肌细胞,用缺氧/复氧法造成培养心肌细胞损伤模型,复氧同时分别给予空白血清冻干粉或含药血清冻干粉,细胞分组同前。分组处理后,正常培养24h,各组检测心肌细胞活力、细胞内钙离子浓度,继而用RT-PCR方法检测钙调节蛋白SERCA2、RyR2的mRNA表达。结果1.生脉散对大鼠急性心肌缺血再灌注性心律失常的影响:再灌注180min内,模型组大鼠再灌注性心律失常的总发生率为83.3%(10/12),各种心律失常的发生率较缺血阶段高,并出现了室性颤扑,死亡率25.0%。普通生脉散低剂量组死亡率11.1%,其它各组无死亡。各生脉散治疗组各种再灌注性心律失常的发生率均有降低,以超微生脉散中、高剂量组和普通生脉散高剂量组尤为明显,降至44.4%(4/9),二者与模型组比较,差异有非常显著性意义(p＜0.01)。2.生脉散对缺血再灌注大鼠LDH、CK-MB的影响:模型组心肌酶LDH、CK-MB均较假手术组升高,分别为1615±176、665.4±39.8u/L和742±153、289.2±42.5u/L,两组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01)。各治疗组的LDH、CK-MB也均高于假手术组,但低于模型组,与模型组比较,差异有非常显著性意义(p＜0.01)。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,超微生脉散降低缺血再灌注损伤所致LDH、CK-MB升高的作用更为明显,差异有非常显著性意义(p＜0.01)。3.生脉散对缺血再灌注大鼠MDA、SOD的影响:模型组MDA均较假手术组升高,分别为6.31±0.52和0.32±0.14nmol/ml,各治疗组MDA也较假手术组升高,它们和假手术组比较,差异均有非常显著性意义(p＜0.01)。各生脉散治疗组MDA均低于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01)。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,各超微生脉散组的MDA值均低于同等剂量的普通生脉散组的MDA值,两者差异有显著性(p＜0.05)。与MDA的变化相反,模型组SOD较假手术组降低,分别为34.5±15.4和89.6±11.5umol/ml,和假手术组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01)。各生脉散治疗组SOD均高于模型组、低于假手术组,和假手术组及模型组比较差异均有非常显著性意义(p＜0.01)。同等剂量的超微生脉散和普通生脉散相比,超微生脉散升高SOD的作用更为明显,两者差异有显著性(P＜0.05),其中超微生脉散高、中剂量组和普通生脉散高剂量组的SOD值略低于假手术组,但与假手术组比较无显著性差异(P＞0.05)。4.生脉散对Bcl-2表达的影响:模型组及各生脉散组Bcl-2的表达较假手术组明显降低,与假手术组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01);同时,各生脉散组Bcl-2表达均高于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01);同剂量的超微生脉散组与普通生脉散组相比,超微生脉散组Bcl-2表达均高于普通生脉散组(P＜0.05)。生脉散对Bax和caspase-3的表达的影响:模型组及各生脉散组Bax和caspase-3的表达较假手术组明显增加,与假手术组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01);同时,各生脉散组Bax和caspase-3的表达均低于模型组,与模型组比较差异有非常显著性意义(p＜0.01);同剂量的超微生脉散组与普通生脉散组相比,超微生脉散高、中剂量组caspase-3的表达均低于同剂量普通生脉散组,两者比较差异有显著性意义(P＜0.05)。5.超微和普通生脉散对缺氧复氧心肌细胞活力的影响:模型组心肌细胞严重受损,心肌细胞活力较正常对照组降低,与对照组相比差异有非常显著性意义(p＜0.01)。预先加入生脉散血清,可见(?)治疗组细胞存活率高于模型组,差异有非常显著性意义(p＜0.01)。说明生脉散血清可以提高RI致心肌细胞损伤时细胞的活力。将超微生脉散和普通生脉散相比较,可以发现,同等剂量超微生脉散血清作用强于普通生脉散。6.超微和普通生脉散对RI心肌细胞内钙的影响:经缺氧复氧处理后,模型组心肌细胞内的钙(112.57±10.97)比正常对照组(75.15±4.87)显著升高,各生脉散治疗组的心肌细胞内钙也较正常对照组有较大幅度升高,但较模型组有不同程度下降,与正常对照组和模型组比较,差异均有非常显著性意义(p＜0.01),提示生脉散血清能抑制缺氧复氧造成的心肌细胞内钙超载。将超微生脉散和普通生脉散血清作用相比较,可以发现,无论是在提高缺氧复氧损伤后所致的心肌细胞活力下降方面,还是在降低缺氧复氧损伤后所致的心肌细胞内钙超载方面,同剂量超微生脉散血清作用均强于普通生脉散血清,两者比较差异均有显著性(P＜0.05),且在实验所用的三种剂量情况下,剂量较高者作用相对较强,但超微生脉散高、中浓度血清治疗组组间差异并不显著(P＞0.05),提示在提高心肌细胞活力及抑制心肌细胞内钙超载方面,超微生脉散中等剂量水平即基本上能达到高剂量水平的效果。7.超微和普通生脉散对RI心肌细胞SERCA2、RyR2的mRNA表达的影响:模型组心肌细胞SERCA2、RyR2的mRNA表达均较正常对照组降低,其相对表达量分别为0.48±0.11、0.47±0.09和0.79±0.09、0.80±0.11,两者比较差异有非常显著性意义(p＜0.01)。各生脉散组SERCA2、RyR2的mRNA表达量也较正常对照组低,但高于模型组,与两者比较,差异均有非常显著性意义(p＜0.01);将同剂量超微生脉散组和普通生脉散组比较,可以发现前者提高SERCA2、RvR2的mRNA的表达作用强于普通生脉散,两者比较差异均有显著性(P＜0.05),且在实验所用的高、中、低三种剂量情况下,剂量较高者作用相对较强,但超微生脉散高、中浓度血清治疗组组间差异并不显著(P＞0.05)。结论1.本研究的结果表明,超微生脉散不仅可以替代普通生脉散发挥抗RI的作用而且在同等剂量下,其作用更强。2.生脉散抗心肌RI的作用,与其抗心肌细胞内钙超载密切相关。本研究首次表明,生脉散抗心肌细胞内钙超载的作用,可能与上调心肌细胞SERCA2、RyR2 mRNA的表达密切相关。这为临床使用超微生脉散治疗心肌RI提供了依据。