针对猪流行性腹泻病毒感染细胞的核酸适配体的筛选及二氧化锰纳米片抗病毒研究

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猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)是严重危害养猪业的两种典型病毒,给我国乃至全世界养猪业造成重大经济损失。建立病毒新的检测方法、发展新型抗病毒手段,对于控制病毒的流行具有重要的意义。本论文采用细胞-指数富集的配体系统进化技术(Cell-SELEX)成功筛选出针对PEDV感染细胞的核酸适配体候选物;研究了二氧化锰(Mn O2)纳米片对PEDV及PRV的抑制效果,具体内容如下:利用Cell-SELEX技术,成功筛选出针对猪流行性腹泻病毒感染非洲绿猴肾细胞(VERO)的核酸适配体候选物。在合成寡核苷酸文库、上游引物及下游引物的基础上,通过琼脂糖凝胶电泳表征方法对初始ss DNA序列进行了鉴定,并利用间接免疫荧光方法探究了PEDV病毒感染VERO合适的时间和剂量。以PEDV感染的VERO细胞为正筛细胞,以正常的VERO细胞为反筛细胞,经过13轮筛选获得了核酸适配体富集文库,借助NUPACK软件对第11轮文库高通量测序结果中的优选序列进行分析和结构预测,最终得到3条核酸适配体候选物。研究结果对PEDV感染VERO细胞表面标志物的发现、PEDV的早期诊断及治疗都具有一定的参考意义。研究了二氧化锰纳米片对猪流行性腹泻病毒和猪伪狂犬病病毒增殖的抑制效果。采用文献报道的合成技术,成功合成了Mn O2纳米片,并对其形貌、结构进行了相应表征。透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)的结果显示Mn O2纳米片呈现二维的微米级片状结构。从Mn O2纳米片的紫外可见吸收光谱(UV-vis)可以看出,在376 nm出现了较强的宽吸收峰,这是由d-d跃迁导致的。376 nm处的吸光度与不同浓度的Mn O2纳米片呈明显的线性相关。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)在700、523和474 cm-1处的特征峰与Mn-O键的弯曲振动和伸缩振动有关。元素mapping分析了Mn和O两种元素的分布特点和丰度情况。这些都证实了二维纳米材料Mn O2纳米片的形成。采用MTT方法研究了Mn O2纳米片对VERO和猪肾细胞(PK-15)的毒性,结果显示低于200μM浓度的Mn O2纳米片处理VERO细胞48 h以内或者低于80μM浓度的Mn O2纳米片处理PK-15细胞48 h以内,细胞的存活率均能达到90%左右。以PEDV和PRV为RNA及DNA病毒模型,运用间接免疫荧光的试验方法探究了Mn O2纳米片对这两种病毒的抗病毒效果。结果证实了Mn O2纳米片对PEDV(RNA病毒)和PRV(DNA病毒)均具有明显的抑制效果。这不仅为PEDV、PRV抗病毒药物的开发提供了新思路,也展现了Mn O2纳米片作为广谱抗病毒纳米材料的应用前景。
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