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研究目的雷公藤甲素（triptolide,TP）又称雷公藤内酯醇,是从雷公藤根中分离出的二萜类化合物[1]，是雷公藤制剂的主要活性成分。近年来，雷公藤的广谱抗肿瘤作用备受医学界关注，其作用机制也成为研究热点。DNA甲基化是表观遗传学研究的前沿，研究表明，白血病等恶性肿瘤相关抑癌基因启动子区域CpG岛甲基化，对肿瘤的发生、发展起着重要的作用。去甲基化药物治疗恶性血液病已在临床应用上有较好的疗效。本实验中，我们通过采用不同浓度TP作用于急性髓系细胞株HL-60细胞，采用MTT法、流式细胞术、RT-PCR、 MSP法研究TP对HL-60细胞甲基化状态的影响，探讨其可能的作用机制，为今后药理研究及临床应用提供更多的理论依据。研究方法1四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测HL-60细胞增殖抑制率；2流式细胞术检测HL-60细胞的凋亡率、细胞周期改变；3实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测DNMT1、DNMT3B、DAPK-1mRNA的表达；4甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）法检测LINE-1、DAPK-1基因的甲基化状态。结果1.MTT检测结果示（表2）： HL-60细胞和不同浓度的TP共同培养24h、48h后，不同浓度TP对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用。TP处理组的细胞增殖抑制率随TP药物浓度增加、作用时间延长而升高，呈时间-剂量依赖性。其24h半数抑制浓度(IC50)约为25nmol/L。2.流式细胞术检测结果：（1）细胞凋亡率检测结果示：以HL-60细胞为对照组，不同浓度TP(3.125nmol/L、6.25nmol/L)作用48h后，可见细胞凋亡，早期凋亡率分别为（2.071.91）%、（5.602.13）%、(9.773.52)%,且6.25nmol/L组与对照组相比早期凋亡率明显增加（F=6.488,P＜0.05)。（2）细胞周期检测结果示(表3)： TP作用HL-60细胞48h后，在TP低浓度时S期细胞数增加，随着TP浓度的增加，S期细胞数下降，G1期细胞数增加，但48h细胞周期改变不明显，各组间尚不能认为有统计学差异。（x s, n3，P＞0.05）3.实时荧光定量PCR检测结果示（表4）：与对照组比较，随着TP浓度增加，DNMT1、DNMT3B的表达逐渐减少，而DAPK-1则表达增高，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（P＜0.01）。4.甲基化特异性PCR检测结果示：对照组HL-60细胞的LINE-1、DAPK-1基因的启动子均呈高甲基化状态，经TP作用48h后，可见LINE-1、 DAPK-1甲基化条带减弱，非甲基化条带增强，表明LINE-1、DAPK-1基因的甲基化程度减弱，且去甲基化程度随药物浓度的增加而增强。结论1.TP可以明显抑制HL-60细胞增殖，有效诱导HL-60细胞的凋亡；2.TP可呈剂量依赖性的抑制HL-60细胞甲基转移酶DNMT1、DNMT3B mRNA的表达，从而影响细胞DNA甲基化的调控；3.TP可以剂量依赖性的影响HL-60细胞DNA重复序列LINE-1基因的甲基化状态，反映了TP对HL-60细胞甲基化状态广谱的影响；4.对照组HL-60细胞抑癌基因DAPK-1mRNA的表达量低，这与其基因启动子区CpG岛的甲基化有关，TP作用后逆转DAPK-1基因的甲基化，恢复或增加DAPK-1mRNA的表达，从而激活某些信号通路诱导细胞凋亡。