论文部分内容阅读
目的心肌成纤维细胞是心脏发生纤维化的主要效应细胞,影响心肌成纤维细胞的生长可以有效地抑制心肌纤维化的发生发展。通过本课题组前期研究,我们确定了长链非编码RNA中的LncRNA GAS5对心肌成纤维细胞的焦亡以及心脏纤维化起到重要的作用。进一步的研究表明,DNMT1的下调通过逆转心脏成纤维细胞中的启动子高甲基化而导致GAS5表达增加。本实验我们旨在通过研究LncRNA GAS5对心肌成纤维细胞焦亡调控的机制,为心脏纤维化提供了新的治疗目标。方法取SD大鼠40只,随机分为实验组与对照组,各20只。实验组大鼠皮下注射ISO,对照组大鼠皮下注射生理盐水,连续两周。HE和Masson,Sirius染色观察大鼠心脏组织的病理学改变。Western blot以及qRT-PCR分析组织中caspase1,NLRP3,DNMT1和Col11的表达。提取SD乳鼠的心肌成纤维细胞,瞬时转染LncRNA GAS5的过表达质粒(pc DNA3.1-GAS5)及其阴性对照,LncRNA GAS5的si RNA(si GAS5)及其阴性对照,24小时后收集细胞,用qRT-PCR检测GAS5,DNMT1,一型胶原(Col 1),NLRP3的mRNA的水平表达。Western blot分析caspase 1,NLRP3,DNMT1的蛋白表达变化,流式细胞仪,Hoechst 33358染色检测细胞焦亡情况。瞬时转染siDNMT1,用qRT-PCR检测其对LncRNA GAS5表达以及LPS诱导心肌成纤维细胞焦亡的影响,用qRT-PCR和Western blot分析siDNMT1对NLRP3表达变化的影响。结果与正常对照组相比较,经ISO处理后的心肌纤维化组,HE,Masson和Sirius染色显示心脏纤维化组织明显增生,分布更密集。Western blot分析结果显示DNMT1,Col1和焦亡相关的蛋白caspase1和NLRP3的表达增加。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,经ISO诱导后的心肌组织,GAS5的表达量明显下降,DNMT1和Col1的mRNA,caspase1和NLRP3的mRNA表达显着增加。在体外,用LPS刺激心肌成纤维细胞,qRT-PCR结果显示经LPS诱导的心肌成纤维细胞中DNMT1和Co l1A1的表达显着增加,LncRNA GAS5的表达显着降低。Western印迹结果表明,经LPS诱导后,DNMT1和Col1A1表达显着增加。Hoechst 33258染色表明,LPS诱导后的CFs焦亡明显增加。qRT-PCR结果显示转染siDNMT1的CFs中GAS5的表达显着增加,DNMT1和caspase 1的表达显着降低。qRT-PCR显示转染pc DNA3.1-GAS5的CFs中,GAS5表达显着增加,而caspase1表达水平显着降低。转染si GAS5的CFs中GAS5的表达显着降低,caspase 1表达水平显着增加。流式细胞仪检测显示,si GAS5转染后的细胞焦亡增加,转染pc DNA3.1-GAS5后细胞焦亡减少。siDNMT1转染的CFs中,NLRP3的表达显着降低,转染pc DNA3.1-GAS5的CFs中NLRP3的表达明显降低,而转染si GAS5的CFs中NLRP3的表达明显升高。结论在ISO诱导下的SD大鼠心肌纤维化模型当中,GAS5的表达量明显下降,DNMT1的表达显着增加,焦亡相关的蛋白表达增加。在体外中,LPS诱导后的CFs中,GAS5的表达量明显下降而DNMT1和NLRP3的表达显着增加。反过来GAS5的高表达会引起细胞焦亡减少,而DNMT1低表达可以导致GAS5表达量增加以及细胞焦亡减少。因此我们可以得出结论,DNMT1沉默的LncRNA GAS5可以通过抑制NLRP3进而减少细胞焦亡的发生发展。