论文部分内容阅读
本研究运用细胞培养、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和Western bloting等免疫学和细胞分子生物学技术,选用BAPTA/AM钙离子鳌合剂靶向耗竭胞内钙离子活性,综合研究和观察了hsBAFF诱发B淋巴细胞胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)变化及其与B淋巴细胞ERK1/2活性和增殖的关系,探讨了hsBAFF上调B淋巴细胞[Ca2+]i水平的作用和分子机理。结果如下:
1、hsBAFF对体外培养的脾脏B淋巴细胞[Ca2+]i的影响
研究hsBAFF对体外培养的鼠脾脏B淋巴细胞胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响,探讨hsBAFF调控B淋巴细胞增殖的细胞学机制。分离的原代培养小鼠脾脏B淋巴细胞,分为对照组和3个hsBAFF处理(1.0、2.5和5.0 μg/ml)组。分别在实验后0h、12 h、24 h,收集细胞并用单抗B220标记以显示B淋巴细胞,再以荧光探针Fluo-3/AM负载,然后通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)或流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分析B淋巴细胞内Ca2+荧光强度。结果显示,hsBAFF处理组B淋巴细胞较对照组细胞形态好、活力强:[Ca2+]i荧光强度显著高于对照组,且Ca2+荧光强度的变化发生在hsBAFF刺激细胞增殖前。暗示:hsBAFF能够通过上调细胞[Ca2+]i水平活化B淋巴细胞。
2、hsBAFF增强[Ca2+]i稳态调控B淋巴细胞增殖和反应
探讨hsBAFF增强[Ca2+]i稳态的作用和意义。采用抗CD-19磁珠分离纯化B淋巴细胞。分离的B淋巴细胞接种到96孔培养板,实验分为对照组(PBS)、标准品hBAFF(2μg/ml)和5个hsBAFF(0.5,1,2,3和5μg/ml)处理组。采用MTT法分析hsBAFF对B淋巴细胞增殖作用。纯化的鼠脾B淋巴细胞接种到96孔培养板,实验分为对照组、hsBAFF(2.5μg/ml)处理组、Tg(0.5μM)处理组和hsBAFF+Tg处理组,各处理组细胞在培养箱中培养48h(37℃,5%CO2)后,采用MTT分析细胞存活率。结果显示,hsBAFF以剂量依赖的方式刺激B淋巴细胞增殖且明显高于对照组。2μg/ml的hsBAFF和标准品hBAFF作用B淋巴细胞效应相近。Tg明显降低B淋巴细胞存活率,然而,hsBAFF明显削弱或缓解Tg导致的B淋巴细胞活力降低。暗示:hsBAFF在增强B淋巴细胞[Ca2+]i稳态调控B淋巴细胞增殖和反应中具有重要作用。
3、hsBAFF增强[Ca2+]i调控B淋巴细胞ERK1/2活性机理研究
采用抗CD-19磁珠分离B淋巴细胞;选用BAPTA/AM钙离子鳌合剂靶向耗竭胞内钙离子活性,以细胞免疫化学和Western Blot技术分析hsBAFF(2.5μg/ml)和BAPTA/AM(20μM)。单一或联合作用B淋巴细胞ERK1/2磷酸化表达。探讨hsBAFF增强[Ca2+]i调控B淋巴细胞ERK活性机理。结果显示,hsBAFF引起磷酸化ERK1/2水平从4 h开始明显上升一直持续到24 h,但当BAPTA/AM耗竭hsBAFF增强的[Ca2+]i时,在24 h内的每一个时间点ERK1/2磷酸化明显下降。提示:hsBAFF上调[Ca2+]i连接着ERK1/2信号的激活,进而促进B淋巴细胞增殖。