水母和海葵都是低等的无脊椎动物，同属于腔肠动物门。它们作为世界海域内常见的海洋有毒生物的代表物种，严重威胁着海滨旅游者和近海渔业等人员的健康。每年世界各地都有水母致伤和海葵致伤的报道。沿海有毒有害生物致伤与中毒是海洋特殊环境医学的重要组成部分。对我军而言，有毒有害海洋生物伤的防治是反“台独”和维护南海主权应急作战训练、实战以及和平时期岛屿防御所面临的重要医疗卫生课题。近年来研究发现，水母和海葵的主要致毒物质大多为肽类毒素，具有溶血、心血管、呼吸、神经、肌肉、酶及离子通道抑制等多种生物活性。　　 由于每一个蛋白质都具有与其它蛋白质不同的等电点和分子量，可利用等电聚焦电泳和SDS—PAGE结合的双向凝胶电泳(Two—dimensional Gel Electrophoresis，2—DE)技术将不同的蛋白质按照等电点和分子量的不同进行分离开来，可以了解一个器官、一个组织或一个时刻全部的蛋白质信息，是近年来广泛应用于蛋白质组学研究的重要技术。本课题选取了我国东海和南海常见的白色发形霞水母(Cyaneacapillata)和巨形列指海葵(Stichodactyla gigantea)作为研究对象，尝试构建水母刺丝囊和海葵触手的蛋白质二维电泳图谱并进行初步比较，为水母和海葵中毒素蛋白的分离、纯化以及活性研究工作奠定基础。　　 在获得蛋白质二维图谱的基础上，本课题着重对前期实验得到的一种海葵溶细胞素Gigantoxin—4进行了重组表达及初步的活性研究。　　 主要的研究方法和实验结果如下：　　 一、水母刺丝囊毒液与海葵触手毒液的2D—PAGE图谱的建立与初步分析　　 选取我国沿海具有代表性的发形霞水母和巨形列指海葵，通过自溶、匀浆、离心等方法得到水母刺丝囊和海葵触手组分。利用二维凝胶电泳技术，以固相pH梯度等电聚焦为第一向，SDS—PAGE作为第二向电泳，然后通过硝酸银染色，得到了这两种生物毒液在pH3～10范围内的蛋白质二维电泳图谱。再利用蛋白质组学图像分析软件PDQuest对图谱进行分析，可以从两种蛋白质图谱中分别得到285和164个清晰的蛋白质点。比较它们的分布、组成，为水母刺丝囊细胞和海葵触手中毒素的分离鉴定和功能活性研究提供指导和奠定基础。　　 二、Gigantoxin—4的基因克隆和序列分析　　 本实验室前期的实验研究已经从巨形列指海葵触手中分离纯化得到一种具有高溶血活性的蛋白质，根据物种和发现顺序命名为Gigantoxin—4。以其N端氨基酸序列和其它已报道的类似毒素的保守序列设计引物，采用RT—PCR的方法从巨形列指海葵触手中克隆得到编码Gigantoxin—4的全长cDNA序列。碱基测序结果与N端测序和质谱鉴定结果对比后最终确定编码Gigantoxin—4的碱基序列：　　 AGTGCTTCAGAAGTCGCTGGCACAATTATCGAAGGGGCAAGTCTAACTTTCCA　　 AATCCTTGACAAAGTACTCACAGAACTTGGTAATGTGTCTCGGAAGATTGCTA　　 TCGGTATCGACAACGAGTCAGGAGGGTCATGGACAGCAATGAATGCATATTTC　　 CGTTCTGGTACTACAGACGTCATTCTACCAGAGTTTGTCCCAAACAATAAAGC　　 GCTACTCTACAGCGGTCGGAAGGACACACGGCCCTGTTACAACGGGCGCTGTG　　 GGTGCCCTTGCCTATTACATGAGCGATGGAAACACTCTTGCCGTTATGTTCAGC　　 GTTCCCTTTGACTACAACCTGTACAGCAACTGGTGGGATGTCAGAGTCTATAG　　 TGGGAAGAGGAGAGCCGACCAAAAGATGTACGAAGACCTCTATAATGGCTCT　　 CCATTTAAAGGGGACAATGGATGGCACCAGAAGAATCTTGGATATGGACTGAG　　 GATGAAGGGAATCATGACAAGTGCTGGCGAAGCAAAACTGCAAATTAAGATT　　 TCACGCTAA。利用生物信息学分析软件对Gigantoxin—4的碱基序列和氨基酸序列进行分析，并对毒素Gigantoxin—4可能的理化性质以及蛋白质构象进行预测和分析。得知Gigantoxin—4的理论分子量为19．5 kDa，等电点为9．14。通过cDNA序列的数据库比对，发现在Gigantoxin—4前端存在一个信号肽序列，在Gigantoxin—4的合成和定位中发挥作用；以及一个长度为15 aa可能是海葵溶细胞毒素特有的propart结构。编码Gigantoxin—4的核苷酸序列中并没有发现常用限制性内切酶的酶切位点，在Gigantoxin—4中并没有发现形成二硫键的半胱氨酸的存在，而且氨基酸密码子的使用上也没有明显的偏好性，为后续重组表达载体的选择提供了便利。将Gigantoxin—4进行数据库比对，进行相似性分析并构建进化树，我们找到了几种同样具有溶细胞作用的海葵毒素，它们的氨基酸序列相似性达到了80％以上。通过膜结合区域的预测我们找到了存在于海葵溶细胞素家族与质膜结合作用的保守氨基酸序列。通过二级结构预测得知Gigantoxin—4的主要以β折叠和卷曲结构为主，还有少量的α螺旋。三级结构预测结果提示我们Gigantoxin—4的分子构象可能是与EqtⅡ类似的三明治结构。这些结果为后续的重组表达系统的构建和相关生物学实验奠定了基础。　　 三、Gigantoxin—4的重组表达及活性研究　　 根据限制性内切酶ECORⅠ和HindⅢ的特异性酶切位点设计一对表达引物，以原核表达载体pET—32a(+)和pMAL—c2x为载体，然后通过酶切、连接、转化等分子克隆技术方法，构建得到符合读码框的重组质粒pET—32a(+)—Gigantoxin—4和pMAL—c2x—Gigantoxin—4，筛选得到稳定表达的工程菌株DH5α，插入序列经测序鉴定正确。然后将重组载体pET—32a(+)—Gigantoxin—4和pMAL—Gigantoxin—4转化入大肠杆菌E．coli BL21，用IPTG诱导转化菌大量表达，摸索了其稳定表达的条件，得到两种目的重组Gigantoxin—4蛋白，再分别利用Ni2+—NTA亲合树脂和Amylose亲合树脂对质粒pET—32at(+)表达蛋白和pMAL—c2x表达蛋白进行纯化，SDS—PAGE分析其表达形式和纯化结果，分别在37 kDa和60 kDa处看到表达目的条带，并通过Western blot方法用His—Tag抗体成功鉴定目的蛋白。说明本实验成功建立了Gigantoxin—4的原核表达系统，能够将目的蛋白进行可溶性表达。　　 通过对重组Gigantoxin—4进行溶血活性实验，发现pET—32a(+)—Gigantoxin—4重组蛋白具有溶血活性，HA50=8．6μg/ml。而pMAL—c2x—Gigantoxin—4重组蛋白则没有检测出明显的溶血活性。通过相对应的肠激酶和Xa因子将表达标签切除之后，两种重组蛋白的溶血活性得到显著提高，其溶血活性分别为HA50=0．81μg/ml和HA50=0．89μg/ml。说明了表达标签的存在影响了重组Gigantoxin—4的溶血活性。　　 总之，本课题建立了发形霞水母刺丝囊毒液和巨形列指海葵触手毒液的蛋白质二维电泳图谱，通过构建原核表达系统成功重组表达了从巨形列指海葵触手中分离纯化得到的具有溶血活性的蛋白质Gigantoxin—4，并进行了活性鉴定，为今后深入研究Gigantoxin—4的理化性质及生物学作用机制奠定了基础，也为制备Gigantoxin—4的抗体提供了可能。上述实验对海葵致伤的预防和治疗提供了有益的数据。