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琥珀抑制是指在翻译过程中抑制琥珀密码子(UAG)的终止信号,利用该项技术可以控制蛋白合成和扩展遗传密码。在此技术基础上发展的各项蛋白标记和蛋白操作技术已经成功应用到蛋白研究的各个方面,其中通过控制病毒蛋白合成而进行的病毒学研究促进了病毒认知和疫苗发展。柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3, CVB3)是一类常见的感染人病毒,与常见的脊髓灰质炎病毒、肠病毒71型等同属小RNA病毒科-肠病毒属。一方面,CVB3的急性感染是导致病毒性心肌炎的主要原因,一部分患者可发展为扩张型心肌病；另一方面,越来越多的研究表明CVB3感染与I型糖尿病等慢性综合征相关。尽管CVB3感染危害众多,但是目前仍然没有有效的疫苗和针对性药物,临床患者只能对症治疗。本研究针对CVB3临床疫苗缺失,提出了利用琥珀抑制手段探究新型CVB3疫苗的研制思路,希望能探索出一种有效的CVB3完整病毒颗粒疫苗株制备方法。此思路的主要原理是,当在CVB3基因组开放阅读框中插入一个UAG琥珀密码子时,便形成了琥珀抑制依赖的CVB3：在人为控制下,该CVB3重组株通过表达识别UAG的aaRS/tRNA正交对,抑制琥珀信号,合成完整的活性病毒颗粒；而将前述CVB3病毒颗粒自然释放时,由于缺乏琥珀抑制系统,CVB3病毒并不能增殖。由此,具有与天然CVB3病毒颗粒结构完全相似却不能增殖的突变CVB3正是安全、优秀的疫苗候选物。为了通读重组病毒ORF中的UAG密码,我们构建了真核表达系统适用的琥珀抑制系统。首先,我们将从大肠杆菌E.coli中克隆的Tyr氨酰tRNA合成酶基因插入了真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点；紧接着,我们在CMV启动子上游的BglⅡ位点连续插入了四个E.coli来源的H1-tRNACUATyr,转录方向与CMV启动子方向相反以避免相互影响。为了验证构建的琥珀抑制系统的UAG通读效率,我们将EGFP的39位Tyr突变为UAG构建了质粒EGFP-Tyr39UAG。当该质粒与pcDNA3.1-EcYRS/tRNA共转染HEK 293T细胞时,可见绿色荧光；流式细胞术分析表达绿色荧光蛋白的细胞比例表明,与野生型EGFP相比,EGFP-Tyr39UAG通读效率达到了28.4%。通过定点突变技术,我们将CVB3 Nancy重组株的VP4蛋白的Tyr27定点突变为琥珀密码子UAG。通过T7依赖的体外转录,我们获得了带有突变位点的CVB3 Tyr27UAG的mRNA转录产物。将pcDNA3.1-EcYRS/tRNA与CVB3 Tyr27UAG的mRNA先后瞬时转染HEK 293T细胞,并未观察到可见的病毒引起的细胞病变。依据CVB3重组病毒需要盲传的经验,我们将CVB3 Tyr27UAG突变体培养物连续三次盲传入事先瞬转了pcDNA3.1-EcYRS/tRNA的293T细胞中。在第三次盲传时,发现了很少量的病毒引起的细胞病变。由此,我们利用琥珀抑制合成了具有增殖障碍(基因组起始部分有UAG终止信号)的CVB3病毒颗粒。总上,我们的工作是以CVB3为例,通过琥珀抑制技术研究小RNA病毒新型疫苗的报道,对以后CVB3等小RNA病毒颗粒在琥珀抑制、非天然氨基酸插入等方面的研究具有良好的借鉴意义。希望通过进一步发展和改良,琥珀抑制相关的各项技术为CVB3的疫苗研究做成贡献,也为应对突发病毒流行、快速制备疫苗提供一种可行性。