【摘 要】
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漆酶是一种含铜的氧化还原酶,作为一种环境友好型生物催化剂,具有广泛的底物谱,在有机合成中的应用还较少,游离酶稳定性低,不能重复利用。因此本文以课题组前期获得的齿毛菌HYB07菌株发酵生产的漆酶为基础,研究固定化漆酶的制备以及在有机合成中的应用,具体研究结果如下:1、以溶剂热的方法制备了多级孔Cu-BTC和Cr-MOF载体,介孔孔径分别约为9 nm和12 nm,并用于固定HYB07漆酶。确定Cu-B
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漆酶是一种含铜的氧化还原酶,作为一种环境友好型生物催化剂,具有广泛的底物谱,在有机合成中的应用还较少,游离酶稳定性低,不能重复利用。因此本文以课题组前期获得的齿毛菌HYB07菌株发酵生产的漆酶为基础,研究固定化漆酶的制备以及在有机合成中的应用,具体研究结果如下:1、以溶剂热的方法制备了多级孔Cu-BTC和Cr-MOF载体,介孔孔径分别约为9 nm和12 nm,并用于固定HYB07漆酶。确定Cu-BTC载体固定漆酶的最适条件为:pH 5.0,温度20℃,加酶量50 U/mg载体,固定3 h,固定化效率为67.7%,固定化漆酶活力为1933 U/g,载酶量为381 mg/g;确定Cr-MOF载体固定漆酶的最适条件为:pH 4.0,温度20℃,加酶量40 U/mg载体,固定2 h,固定化效率为64.8%,固定化漆酶活力为1564 U/g,载酶量为337 mg/g。2、表征了固定化漆酶的酶学性质。pH 3.0时,游离漆酶和固定化漆酶表现出最高的活力,但固定化漆酶在pH 4.0-10.0都保留70%以上活力,pH作用范围更广。游离漆酶和固定化漆酶的最适反应温度均为50℃,但固定化漆酶比游离漆酶具有更好的热稳定性。40℃时,Cr-MOF漆酶和Cu-BTC漆酶的失活半衰期分别为927 min和967 min,比游离酶分别延长了148 min和188 min;在55℃时,Cr-MOF漆酶和Cu-BTC漆酶的失活半衰期分别比游离酶延长了47 min和68min。在Ca2+、Co2+、K+、Sr+、Ba2+、Mn2+和Na+等金属离子（10 m M）作用下,固定化漆酶活力受抑制程度较低,体现了更好的金属离子耐受性;甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和二甲基甲酰胺等有机溶剂（20%体积比）作用下,固定化漆酶均保留了60%以上活力,比游离漆酶有机溶剂耐受性更好。Cr-MOF漆酶和Cu-BTC漆酶储存21 d后相对酶活分别为95.1%和94.2%,比游离酶（85.3%）有所改善。3、游离漆酶催化酪醇聚合的最适条件为pH 5.0,温度40℃,加酶量4 U/m L,反应4 h,转化率可达到98%;固定化漆酶催化的最适条件为pH 5.0,温度40℃,加酶量1.2 U/m L,反应3 h,转化率为98%。两种固定化漆酶在重复催化酪醇5次后,都仍有50%以上转化率。漆酶催化酪醇合成的主要产物为酪醇二聚体。4、游离漆酶催化阿魏酸乙酯（EF）聚合的最适条件为pH 4.0,温度40℃,加酶量2 U/m L,反应90 min,转化率可达92%;固定化漆酶催化的最适条件为pH 4.0,温度40℃,加酶量0.8 U/m L,时间90 min,转化率在92%。两种固定化漆酶在重复催化EF 5次后,都仍有50%以上转化率。漆酶催化EF合成的产物主要为EF二聚体。
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