铁离子是微生物生存的必需元素,许多重要的生命过程都需要铁离子的参与,包括N2的固定,DNA的合成和细胞呼吸等。尽管铁元素在地壳中的含量非常丰富,然而铁离子在有氧条件下的溶解度极低,因此铁缺乏是微生物生境适应和发挥生物学活性的重要限制因素。铁在人体内的含量非常丰富,但自由铁离子含量却极低。在人体发生炎症或者感染期间,宿主细胞可以通过急性反应,进一步降低代谢循环中的自由铁含量,从而阻止入侵微生物的繁殖。这种营养限制型对抗策略统称为营养免疫。因此,病原微生物在动物体内将面临着更加严峻的缺铁挑战,缺铁条件下争夺铁离子的能力是影响病原微生物致病性的重要因素。为了适应复杂多变的生存环境或对抗宿主的营养免疫,大肠杆菌已经进化出非常复杂且高效的铁离子吸收系统。以最主要的铁载体转运系统为例:大肠杆菌可以向细胞外分泌对三价铁离子具有高度亲和力的铁载体(又称嗜铁素),铁载体与环境中的三价铁离子结合,形成的铁-铁载体复合物被外膜上特异性的受体蛋白识别并结合,在TonB-ExbB-ExbD介导的能量转换系统的协助下进入细胞周质。细胞周质蛋白将铁-铁载体运送至内膜的ABC透性酶转运体上,在消耗ATP的同时将铁-铁载体转入细胞质中。在细胞质中铁离子和铁载体分离,被还原为对细胞没有毒性的二价铁离子并产生超氧化物自由基,而铁载体被回收重复利用。铁为生命代谢所必需,然而过量的铁却会对细胞产生毒害。细胞内高浓度的铁离子可以通过芬顿反应产生活性氧,导致核酸、蛋白质和细胞膜的损伤。因此,微生物会对细胞内的铁离子浓度进行严格控制,以期在满足生理需求的同时免受这些毒性物质的伤害。而这种全局性的铁稳态维持系统即依赖于铁转录因子Fur(ferric-uptake regulator protein)。Fur为二聚体蛋白质,在许多细菌中高度保守。大肠杆菌Fur含有两个金属离子结合位点:一个位点和Zn2+结合,负责稳定蛋白质的构象;另一个位点与Fe2+结合,负责行使调控功能。经典的Fur调控模型为:当细胞内铁离子充足时,Fur与Fe2+结合,形成的Fur-Fe2+复合物可以与启动子上游的Furbox DNA结合,通过抑制RNA聚合酶的结合,抑制铁吸收基因的表达;当细胞内铁离子不足时,Fe2+与Fur解离,致使Fur的DNA结合能力下降,解除对靶基因启动子的抑制作用,从而激活铁代谢吸收系统的基因表达。这一经典模型依赖于细胞内Fe2+的反馈调节作用。然而随着对Fur同源蛋白的广泛研究,科学家们对Fur的经典调控模型提出了许多挑战。比如慢生型大豆根瘤菌Fur的金属离子结合位点1和位点2突变体仍然能够在体内抑制铁代谢基因的表达。而空肠弯曲杆菌apo-Fur仍然为二聚体蛋白质且可以与目的基因启动子结合。这些现象都暗示着Fur调控机制多样化的存在。鞭毛的驱动可以促进病原微生物在宿主体内的定殖。然而,巨大的细胞外鞭毛也是免疫系统的主要目标。为了成功入侵宿主细胞,避免被宿主先天免疫系统识别,病原微生物必须在黏附、入侵和定殖的过程中精确控制鞭毛基因的表达。因此,许多研究发现,一些细菌中会出现鞭毛合成与铁代谢的协同调控。然而,微生物鞭毛合成与铁代谢协同调控的分子机制还未可知。YdiV是大肠杆菌鞭毛合成的负调控因子。YdiV可以与第一级鞭毛基因合成的FlhD4C2复合物结合,在蛋白质水平抑制FlhD4C2对二级鞭毛基因的激活作用,负调控鞭毛合成,抑制菌体移动性。有趣的是,营养缺乏环境可以激活YdiV的合成,且鞭毛基因的转录也受到营养缺乏条件的抑制。在沙门氏菌的入侵过程中,YdiV同源蛋白STM1697表达量急剧上调,直接证明其在细菌感染中的重要作用。SlyD是一种肽基脯氨酰顺/反异构酶和分子伴侣。大肠杆菌SlyD可以特异性的影响厌氧条件下细胞内的镍离子平衡,并且参与氢化酶成熟过程中Ni2+的组装。本论文以大肠杆菌为研究对象,探讨了 YdiV和SlyD调控大肠杆菌铁离子代谢的分子机制。在本论文中我们首次发现,YdiV除了参与鞭毛调控,还可以通过SlyD解除铁转录因子Fur对下游基因的抑制作用,激活大肠杆菌铁离子吸收系统。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)缺铁环境中YdiV激活大肠杆菌铁离子代谢系统。我们通过荧光定量PCR和ICP-MS实验发现,当大肠杆菌MG1655面临缺铁环境时,ydiV基因上调表达。高浓度的YdiV可以促进铁吸收系统基因fepA,fecB和fhuF的转录激活,进而促进大肠杆菌在缺铁环境中吸收更多的铁离子,有利于其在缺铁环境中的生存。而ydiV基因缺陷菌株在应对缺铁环境时,其铁吸收系统基因的激活、细胞内铁含量以及生长趋势相比于野生型菌株都有所减弱。(2)YdiV抑制铁转录调控因子Fur与DNA结合。我们使用β-半乳糖苷酶酶活测定实验检测了不同YdiV含量菌株中fepA和fhuF基因启动子的转录活性,发现细胞内高浓度的YdiV可以促进Fur对铁代谢基因启动子解除抑制。在大肠杆菌BL21(DE3)中同时过表达YdiV和Fur,不能获得YdiV-Fur二元复合物,只有Fur被纯化出来(FurYdiV)。然而EMSA和FP实验结果显示,纯化出的FurYdiV与Fur box DNA的亲和力比野生型Fur下降了约300倍。因此,我们认为YdiV在细胞内与Fur发生了相互作用,且这种互作产生的影响可以稳定存在,不会因为YdiV的解离被还原。(3)YdiV改变铁转录调控因子Fur的构象。我们对与Furbox DNA亲和力存在明显差异的Fur和FurYdiV进行了多方面的检测比较。其中分子筛层析、ICP-MS和ITC结果显示,这两个蛋白质的聚合状态和金属离子结合性质都没有明显差异。然而,许多线索暗示它们的蛋白质高级结构有所不同。首先,在分子筛层析时,二聚体Fur总是比二聚体FurYdiV略微滞后出峰,这说明Fur和FurYdiV的形状不同。其次,经过高分辨率一级质谱和巯基检测实验确认,Fur中含有一对二硫键,而FurYdiV不含有二硫键。也就是说,细胞内YdiV的浓度升高导致Fur中的二硫键被还原。再者,VP-DSC实验显示FurVdiV的热稳定性高于Fur,即YdiV将Fur的构象变的更加稳定。(4)YdiV调控Fur的构象依赖于脯氨酰顺/反异构酶SlyD。由于YdiV不具备异构酶或者二硫键还原酶酶活,我们推测还有其他未知蛋白参与了YdiV与Fur的相互作用。幸运的是,我们使用pull-down实验结合质谱测序技术寻找到了这一关键蛋白质SlyD。SlyD是一种脯氨酰顺/反异构酶和分子伴侣。EMSA实验显示,敲除slyD基因以后,过表达YdiV不能继续影响Fur与DNA结合。大肠杆菌Fur的DBD结构域含有两个关键的脯氨酸残基P18和P29。通过定点突变技术对Fur进行氨基酸突变发现,Fur P18A的DNA结合活性不再受到YdiV和SlyD的调控,即SlyD对Fur的作用位点为P18。细菌双杂交实验证明YdiV、Fur以及SlyD之间存在细胞内相互作用。核磁共振实验证实,野生型Fur和FurYdiV,SlyD存在明显构象差异。(5)YdiV和SlyD影响UPEC对膀胱上皮细胞的致病性。为了探索YdiV-Fur-SlyD调控模型的生理意义,我们首先使用体外转录实验比较了经典Fur调控模型与YdiV-Fur-SlyD调控模型对fepA基因启动子的抑制效率,发现YdiV-Fur-SlyD调控模型可以更彻底的激活铁代谢基因的转录。而移动性实验显示,铁离子调控蛋白SlyD和Fur不会影响YdiV鞭毛调控功能的发挥,这有利于病原微生物入侵宿主细胞时鞭毛合成和铁代谢的协同调控。最后,我们通过细菌入侵实验首次证明YdiV和SlyD蛋白为尿道致病性大肠杆菌入侵膀胱上皮细胞所必须。根据以上结果我们发现,缺铁环境可以诱导ydiV基因上调表达,细胞内高浓度的YdiV可以在SlyD蛋白的参与下改变Fur的三维构象,将Fur转变为一种不能与DNA结合的形式——FurYdiD,SlyD。FurYdiV,SlyD的产生解除了铁吸收基因启动子的抑制状态,进而激活大肠杆菌铁离子吸收系统,促进了铁的吸收。这一调控机制不依赖于Fe2+的结合,可以在细胞真正缺铁之前维持铁的稳态。我们将这一新型铁稳态调控模型总结如下:在铁丰富环境中,YdiV的表达量较低,而SlyD的含量维持稳定。此时fur基因的转录和翻译以恒定的速度进行,大部分新生Fur蛋白按照正常的构象折叠,形成二聚体并含有一对二硫键(折叠途径I,有活性的Fur)。少部分Fur的新生肽链被SlyD识别,然而没有YdiV的帮助,只有极少部分Fur发生了构象转变。在这种情况下,有活性的Fur占据了大多数,大部分的Fur box DNA被Fur占据,阻止了 RNA聚合酶的结合,抑制铁吸收基因的转录。当大肠杆菌进入了缺铁环境,比如入侵宿主体内,YdiV被一种未知机制激活表达。高浓度的YdiV促进三元复合物YdiV-Fur-SlyD的形成,使Fur中的二硫键被还原,并转变为一种更稳定的且不能与DNA结合的构象(折叠途径Ⅱ,无活性的FurYdiV,SlyD)。FurYdiV,SlyD一旦形成,三元复合物即刻解离,释放出的YdiV和SlyD继续寻找下一个目标,催化更多FurYdiV,SlyD的形成。最终,FurYdiV,SlyD成为主要的存在方式,大部分Fur box DNA被释放,铁吸收基因解除抑制。这一新型调控机制需要SlyD对Fur第1 8位脯氨酸进行顺/反异构化,而YdiV是必不可少的辅助因子,使异构化反应更容易进行。YdiV-Fur-SlyD调控模式的发现首次将鞭毛调控与铁离子代谢紧密结合,有利于病原微生物克服宿主的营养免疫并逃避鞭毛蛋白引起的免疫识别。而细菌入侵实验也证明了 YdiV和SlyD蛋白对尿道致病性大肠杆菌致病性的重要影响。这些结果对于后续有针对性的开发靶向铁离子摄取途径的新型抗生素具有重要的指导意义。