宫颈癌(Cervical cancer,CC)是女性常见恶性肿瘤,发病率在全世界女性肿瘤中位居第二位,仅次于乳腺癌。全世界每年新增病例约50万,死亡病例约30万,而我国CC发病率位居世界第二位,且发病年龄日渐年轻化,严重威胁全球女性生命健康。尽管目前对CC的诊治取得了较大进步,但CC患者的预后和死亡率并没有得到明显的改善。早期的CC患者通过手术治疗可以达到较好的预后,而晚期CC患者5年的生存率只有50%左右,治疗效果不佳。其它治疗手段包括化疗和放疗,但均缺乏特异性,同时具有严重的毒副作用。因此深入探讨CC发生发展的病理机制,寻求更好、更有效的治疗方案对CC的临床防治具有重大意义。e IF5A2基因是e IF5A家族的同源基因之一,定位在染色体3q26.2区,在细胞生长、分化、增殖、凋亡等过程中扮演重要角色。既往研究表明,在卵巢癌、肝癌、膀胱癌及食管鳞状细胞癌等多种实体瘤组织中存在e IF5A2异常表达,并作为肿瘤恶性程度高的标志物之一。而e IF5A2沉默能够有效抑制肿瘤细胞恶性增殖、促进细胞凋亡,降低其侵袭转移能力。近年研究发现,e IF5A2在宫颈癌组织中的表达显著升高,且与FIGO分期、淋巴血管侵犯、盆腔淋巴结转移等临床病理参数高度相关,但其在宫颈癌中的具体分子调控机制尚不明确,因此e IF5A2对宫颈癌细胞生物学功能的影响仍需进一步探索。越来越多的研究发现,Rho A/ROCK信号通路在多种肿瘤中持续性激活,且与肿瘤细胞生长、凋亡、侵袭迁移及恶性进展密切相关。另有研究证实,e IF5A2基因通过调控Rho A/ROCK信号通路相关蛋白表达介导胰腺癌侵袭转移。此外,e IF5A2过表达促进肝癌细胞增殖和迁移的同时显著激活Rho A/Rac1信号通路。表明e IF5A2可以通过调控Rho A/ROCK信号通路活性介导肿瘤细胞的增殖和迁移。但e IF5A2在宫颈癌中是否通过Rho A/ROCK信号通路影响肿瘤细胞的生物学活性尚不清楚。本研究采用real-time PCR和western blot分析了e IF5A2表达与CC的相关性;并应用RNA干扰技术降低e IF5A2在宫颈癌Hela细胞中的表达,结合MTT、流式细胞术、克隆形成、划痕实验及Transwell等实验观察e IF5A2基因干扰对CC细胞增殖周期和迁移的影响;为探讨相关的分子机制,本研究检测了Rho A及ROCK在CC组织中的表达,并通过构建Rho A过表达载体及干扰片段研究Rho A异常表达对CC细胞增殖和迁移的影响;最后在e IF5A2基因干扰基础上转染Rho A过表达载体,深入探讨e IF5A2基因对Rho A/ROCK信号通路的调控作用,明确e IF5A2基因在CC发病、进展中的作用和具体分子机制。本研究结果旨在进一步阐明CC的发病机理,并为宫颈癌临床防治提供新型分子靶点和更多理论依据。1.e IF5A2在宫颈癌组织中的表达分析目的:分析e IF5A2在CC组织和癌旁正常组织中是否存在差异表达,论证e IF5A2基因同CC发病存在相关性。方法:采集15对CC和对应的癌旁正常组织样本,real-time PCR技术检测各样本中e IF5A2 m RNA表达,western blot技术检测各样本中e IF5A2蛋白表达,分别从m RNA和蛋白水平分析e IF5A2与CC发病的关系。结果:同癌旁正常组织样本比较,e IF5A2 m RNA和蛋白在CC组织样本中的表达均显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:成功证实e IF5A2在CC组织中异常高表达,进一步明确了e IF5A2可能成为人类肿瘤病理诊断的重要分子标志和临床治疗的潜在分子靶点。并为应用Real-time PCR或免疫组化技术分析e IF5A2在宫颈活检组织中的表达进行CC病理诊断奠定了一定的理论基础。2.e IF5A2基因干扰对宫颈癌细胞增殖、迁移的影响目的:明确e IF5A2基因干扰对Hela细胞增殖和迁移的影响。方法:通过构建e IF5A2干扰载体,转染Hela细胞并采用G418筛选e IF5A2稳定干扰细胞。实验设计:空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和e IF5A2-sh RNA干扰组(she IF5A2)。通过MTT实验检测e IF5A2干扰对Hela细胞增殖的影响;PI单染流式细胞术分析各组细胞周期变化;克隆形成实验观察各组细胞增殖能力;划痕实验及Transwell实验检测各组细胞迁移能力。结果:e IF5A2基因干扰后,MTT检测结果显示细胞增殖能力显著下降(p<0.05);流式细胞术检测细胞周期结果显示G0期细胞比例增加,S期和G2期细胞比例明显减少(p<0.05或p<0.01);细胞克隆形成实验结果显示细胞克隆形成率显著降低(p<0.05);划痕实验及Transwell实验结果显示细胞迁移能力显著减弱(p<0.05)。结论:e IF5A2基因干扰能将Hela细胞阻滞于G0期,有效抑制细胞增殖和细胞迁移。3.e IF5A2基因影响宫颈癌细胞增殖、迁移的分子机制目的:(1)分析Rho A表达与CC临床病理参数的相关性,明确Rho A过表达或干扰对CC细胞增殖和迁移的影响。(2)明确e IF5A2基因干扰对CC细胞中Rho A/ROCK信号通路活性的影响以及e IF5A2基因是否通过调控Rho A/ROCK通路介导Hela细胞增殖和迁移。方法:(1)采集46例CC和34例宫颈炎组织样本,Western blot技术检测Rho A及ROCK在各组织样本中的表达,分析Rho A同患者年龄、肿瘤体积、HPV感染、FIGO分期、血管浸润、淋巴结转移、雌激素受体及孕激素受体的相关性;构建Rho A过表达及干扰片段,分别转染Hela细胞。实验设计:A空白对照组(Hela)、B空载对照组(Hela-Con)、C Rho A过表达组(Hela-Rho A+)、D阴性对照组(si RNA-Con)、E Rho A干扰组(si RNA-Rho A)。通过CCK-8实验检测Rho A异常表达对CC细胞增殖的影响,划痕实验检测细胞迁移能力变化。(2)western blot检测Control组、NC组和she IF5A2组中Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ的表达,验证e IF5A2基因干扰对Rho A/ROCK通路具有调控作用后,构建Rho A过表达载体并转染e IF5A2基因稳定干扰的Hela细胞,实验设计:NC组、she IF5A2组、she IF5A2+空载转染组(Vector)和she IF5A2+Rho A过表达组(Rho A)。通过MTT实验检测Rho A过表达对e IF5A2干扰细胞增殖能力的影响,划痕实验分析各组细胞迁移能力变化。结果:(1)与对照组比较,Rho A、ROCKⅠ和ROCKⅡ在CC组织中的表达显著增加(p<0.05或p<0.01),且同FIGO、血管浸润及淋巴结转移高度相关;Rho A过表达后,CCK-8实验结果显示细胞增殖能力显著增加(p<0.05或p<0.01),划痕实验结果显示Hela细胞迁移能力显著增强(p<0.01),而干扰Rho A能有效抑制细胞增殖和迁移(p<0.05)。(2)western blot结果显示e IF5A2基因干扰后Rho A、ROCKⅠ、ROCKⅡ的表达显著降低(p<0.05);在e IF5A2基因干扰基础上转染Rho A过表达载体后,同she IF5A2组比较,MTT和划痕实验检测结果显示Rho A过表达部分逆转了e IF5A2干扰对Hela细胞的调控作用,Hela细胞的增殖和迁移能力均显著上升,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。结论:(1)Rho A在宫颈癌组织中异常高表达,且同肿瘤临床分期和侵袭转移密切相关,Rho A过表达显著促进宫颈癌细胞增殖和迁移。(2)e IF5A2基因通过激活Rho A/ROCK信号通路,增加Rho A、ROCKⅠ、ROCKII的表达诱导Hela细胞增殖,促进细胞迁移。