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猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PRV)属于呼肠病毒科轮状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一,1-4周龄仔猪的发病率超过80%,死亡率可达20%,该病在世界范围内分布,其感染引发的腹泻已发展成为一种世界性的疾病,给各国的畜牧业造成了严重的危害,有效的疫苗接种是目前预防该病的唯一途径,而现有疫苗存在着易发生毒力回复、异型间免疫效果差的缺憾。伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PrV)属于疱疹病毒甲亚科水痘病毒属,病毒在猪群中的传播引起妊娠母猪流产、死胎等繁殖障碍及呼吸系统疾病,有传播速度快、传播途径多、流行范围广、致死率高的特点,给养猪业造成了巨大损失,在伪狂犬病的防控中广泛使用的Bartha-K61株等弱毒疫苗被证明是疫苗研制成功的典范,目前研究热点正转为利用生物技术研制重组伪狂犬病毒活载体疫苗方面。本研究中,首先进行了PRV/JL94株的细胞培养和超离纯化,并提取病毒核酸进行研究。根据学者们的观点:vp4基因对轮状病毒的致病力起着关键性的作用;VP4还是重要的中和性抗原,能够刺激机体产生中和抗体,对机体有免疫保护作用;一个VP4血清型别可能包含几个VP7型别,因此选定vp4基因片段研发疫苗,能减少不同型别间免疫效果差的问题,对疾病的防控更有现实意义。学者们认为,vp4基因5’端长750bp的特异性片段主要决定其生物特性,是vp4的主要抗原功能结构区。所以,本研究根据JL94/vp4全基因序列,通过RT-PCR技术克隆其5’端1-756bp(包括全部的VP8区、胰酶区和VP5的N端),命名为vp4主要抗原位点基因(vp4 Major Antigen Site Gene, vp4-MASG)并进行序列分析,结果表明vp4-MASG基因片段与国外分离株CRW-8株、Gottfried株同一基因片段氨基酸同源性分别是96.43%和67%。同型之间高度保守,不同型间差别较大,其中aa81-207变异性最大。将vp4-MASG同载体pMel BacA连接,与Linear AcMAPV/DNA共转染昆虫细胞Sf9,通过3代蚀斑纯化,筛选出含有vp4-MASG基因的重组杆状病毒并表达出目的蛋白,光密度扫描分析证实所表达蛋白占细胞总蛋白的26%;Western Blotting显示所表达的蛋白有较好的免疫反应性;经纯化的表达蛋白免疫小鼠所得血清能阻止PRV在MA104细胞上形成的细胞病变,说明表达蛋白有免疫原性。构建的表达PRV/vp4基因的重组杆状病毒可以作为亚单位疫苗侯选株,它不含有轮状病毒核酸,不存在毒力回复问题,高安全性和高表达量是其最大特点。轮状病毒性腹泻和伪狂犬病是危害养猪业的两大重要传染病,是否可以利用成功的伪狂犬病毒疫苗株作为活载体表达轮状病毒基因,力争同时防治这两种疾病呢。实验中,将vp4-MASG插入到本课题组构建的gG伪狂犬病毒转移载体多克隆位点上,该转移载体以伪狂犬病毒非必需基因的部分序列作为同源臂,在其间插入gG Promoter、多克隆位点、PolyA、CMV Promoter及其控制的LacZ基因,构建出含有目的基因vp4-MASG和报告基因LacZ的转移载体vp4-MASG-gG;将其与PrV弱毒疫苗株Bartha-K61株(gE?/gI?)病毒基因组DNA,通过脂质体法共转染Vero细胞,经显微镜下挑斑技术的筛选纯化及PCR鉴定,获得了一株表达目的基因的重组伪狂犬病毒,命名为vp4-MASG-PrV;生长动力学实验显示重组病毒