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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是导致人类结核病(tuberculosis,TB)的病原菌,全世界大约有三分之一的人口潜伏感染结核分枝杆菌。有研究表明,双组分调控系统KdpD/E在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中发挥重要作用,并参与细菌毒力的调节,但具体的作用机制目前尚不清楚。本研究在结核分枝杆菌中缺失了双组分调控系统KdpD/E,并对该系统在入侵巨噬细胞、胞内存活以及毒力调节过程中的作用进行了研究。1.双组分调控系统KdpD/E基因缺失株的构建与鉴定构建目的基因等位交换底物并克隆到含有温敏型分枝杆菌噬菌体元件的穿梭载体phAE159上,等位交换底物经噬菌体高效传递到待敲除菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性克隆子并通过PCR进行鉴定,结果表明结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD/E基因缺失株ΔkdpD、ΔkdpE、ΔkdpDE构建成功。2.基因缺失株与野生株生物学特性的比较本研究通过测定缺失株与野生株OD600以及CFU与时间的对应关系曲线,发现双组分调控系统KdpD/E的缺失对菌株的生长未造成明显的影响。实验还比较了基因缺失株和野生株在固体培养基上的菌落形态,结果显示ΔkdpE、ΔkdpDE的索状结构明显强于野生株,索状结构的变化预示着基因缺失株毒力的上升。3.基因缺失株与野生株入侵巨噬细胞能力以及胞内存活能力的比较在人单核巨噬细胞(THP-1)感染实验中,通过测定细胞内细菌的CFU,本研究发现双组分调控系统KdpD/E的缺失对菌株入侵巨噬细胞没有造成显著影响,但在感染细胞后24h、48h、72h时缺失株Δkdp DE都表现出更强的胞内存活能力。4.KdpE蛋白的表达以及多克隆抗体的制备利用pET-28a载体成功表达了反应调节蛋白KdpE。将纯化后的蛋白免疫日本大耳兔,制备了兔抗KdpE蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示抗体效价可以达到1:64,000。这些工作为进一步研究结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD/E的功能奠定了基础。5.荧光定量PCR筛选差异表达基因通过荧光定量PCR实验,本研究发现KdpD/E缺失后,参与Kdp-ATPase K+转运系统组成的基因kdpA、kdpF表达量显著上调;与抵御不良环境及致病相关的基因lprF、lpr J、lat、ponA2、espA表达量也显著上调,而furA、glyA2、Rv3161c表达量显著下调,这些基因的差异表达与KdpD/E基因缺失株胞内存活能力以及毒力的增强联系密切。