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Toll信号通路是无脊椎动物先天性免疫中的重要一环，对于无脊椎动物抵抗细菌、真菌和病毒等感染具有重要作用。虽然，在甲壳动物中已经鉴定出一些Toll基因，但是在河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)中还没有发现。此外，镉(cadmium， Cd)对Toll基因的影响，在生活于底泥中、易累积重金属的溪蟹类中尚未见报道。我们对河南华溪蟹肝胰腺组织的转录组分析发现，Cd暴露使Toll3基因表达降低。因此，本课题将从以下四个方面对河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因在Cd暴露和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒的应答模式进行研究。主要研究内容包括以下四个方面：
1.河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。通过RACE方法，克隆获得Shtoll1和Shtoll3基因全长序列；预测ShToll1和ShToll3的蛋白结构域，分析ShToll1和ShToll3蛋白各功能结构域的特点；同时，构建相似物种间的系统发育进化树，预测ShToll1和ShToll3的进化地位，并推测它们的功能。同时，取河南华溪蟹血淋巴、鳃、肝胰腺、中肠、肌肉、精巢和卵巢7种组织，提取总RNA并反转录成cDNA，设计特异性引物，用qPCR方法检测Shtoll1和Shtoll3在7种组织的分布模式，分析Shtoll1和Shtoll3参与免疫应答的目标组织。
2.建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。对获得的嗜水气单胞菌菌株进行毒力基因检验，将具有毒力的菌株扩大培养并保存；测定嗜水气单胞菌菌株的菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)，并构建其与菌液浓度OD600的线性关系；通过统计嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹死亡个体数，计算出嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的半数致死浓度LD50，构建嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。通过qPCR方法，分析Shtoll1和Shtoll3基因应答嗜水气单胞菌攻毒的表达模式。
3.分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。河南华溪蟹经Cd暴露7d并注射嗜水气单胞菌24h后，提取河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织的总RNA并反转录成cDNA；采用qPCR方法，检测河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织中，Shtoll1和Shtoll3基因应答Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的表达模式；同时，通过免疫组化方法，分析河南华溪蟹ShToll1蛋白在血淋巴细胞、ShToll3蛋白在中肠和鳃组织中对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。
4.通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。合成分别用于RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3的siRNA，并验证干扰效率。利用westernblotting方法，比较RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3前后，ShToll1和ShToll3蛋白对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化；同时，利用qPCR方法，分析在RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3后，河南华溪蟹Toll信号通路下游AMPs对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化。
综上所述，主要研究结果如下：
第一，河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。河南华溪蟹Shtoll1全长4746bp，其中编码区(open reading frame，ORF)3033bp，可编码含1011个氨基酸的蛋白；Shtoll3全长4488bp，其中编码区3693bp，可编码含1230个氨基酸的蛋白。ShToll1和ShToll3具有典型的Toll结构，即胞外LRR重复结构、跨膜结构和胞内TIR结构。ShToll1和ShToll3胞外LRR结构符合"xLxxLxLxxNxφxxφxxxxFxx"的保守序列模式。ShToll1与大部分甲壳动物Toll1和Toll2聚为一类，ShToll3与甲壳动物Toll3聚为一类。全长序列同一性结果显示ShToll1与CmToll的同一性最高为68.59%，与DmToll3的同一性最低为22.71%；ShToll3与PtToll3的同一性最高为93.22％，与DmToll2的同一性最低为39.31%。组织分布模式结果显示ShToll主要分布在河南华溪蟹血淋巴细胞中，ShToll3主要分布在鳃组织中。
第二，建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。嗜水气单胞菌菌株检测到了aerA、hlyA、alt、ast、ahpB、lip和fla七个毒力基因，其菌落形成单位为3.82×106cfu/mL，其与OD600的关系为y=0.191x+0.045(R2=0.973)，其攻毒河南华溪蟹的LD50为5.2×105cfu/mL。成功构建了嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。嗜水气单胞菌攻毒6h后，Shtoll1在血淋巴细胞中表达量升高，攻毒3h后，Shtoll1在中肠组织中表达量升高，攻毒3、6、12h后，Shtoll1在肝胰腺组织中表达量升高；嗜水气单胞菌攻毒12h后，Shtoll3在中肠组织中表达量下降。
第三，分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。qPCR和免疫组化实验结果显示，在河南华溪蟹血淋巴细胞中，29mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使Shtoll1表达量升高，Shtoll1主要在血淋巴细胞中应答Cd暴露。在鳃和中肠组织中，14.5mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使ShToll3表达量升高，ShToll3主要在鳃和中肠等上皮细胞组织应答Cd暴露。免疫组化结果表明，Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒,使河南华溪蟹血淋巴细胞中ShToll1显色加深；鳃组织中ShToll3显色加深；而中肠组织中ShToll3显色无明显变化。
第四，通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。成功合成了RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3的siRNA，且在血淋巴细胞中，Shtoll1的干扰效率为90%；在鳃和中肠中，Shtoll3的干扰效率分别为68%和78%。分别干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3后，在Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒条件下，ShToll1和ShToll3蛋白水平表达量得到抑制。干扰河南华溪蟹ShToll1后，检测到Toll信号通路下游抗菌肽alf5、alf6和c-lys可能通过Shtoll1参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答；干扰河南华溪蟹Shtoll3后，检测到Toll信号通路下游抗菌肽crustin和c-lys可能通过Shtoll3参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答。
1.河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。通过RACE方法，克隆获得Shtoll1和Shtoll3基因全长序列；预测ShToll1和ShToll3的蛋白结构域，分析ShToll1和ShToll3蛋白各功能结构域的特点；同时，构建相似物种间的系统发育进化树，预测ShToll1和ShToll3的进化地位，并推测它们的功能。同时，取河南华溪蟹血淋巴、鳃、肝胰腺、中肠、肌肉、精巢和卵巢7种组织，提取总RNA并反转录成cDNA，设计特异性引物，用qPCR方法检测Shtoll1和Shtoll3在7种组织的分布模式，分析Shtoll1和Shtoll3参与免疫应答的目标组织。
2.建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。对获得的嗜水气单胞菌菌株进行毒力基因检验，将具有毒力的菌株扩大培养并保存；测定嗜水气单胞菌菌株的菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)，并构建其与菌液浓度OD600的线性关系；通过统计嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹死亡个体数，计算出嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的半数致死浓度LD50，构建嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。通过qPCR方法，分析Shtoll1和Shtoll3基因应答嗜水气单胞菌攻毒的表达模式。
3.分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。河南华溪蟹经Cd暴露7d并注射嗜水气单胞菌24h后，提取河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织的总RNA并反转录成cDNA；采用qPCR方法，检测河南华溪蟹鳃、中肠、血淋巴细胞和肝胰腺四种组织中，Shtoll1和Shtoll3基因应答Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的表达模式；同时，通过免疫组化方法，分析河南华溪蟹ShToll1蛋白在血淋巴细胞、ShToll3蛋白在中肠和鳃组织中对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。
4.通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。合成分别用于RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3的siRNA，并验证干扰效率。利用westernblotting方法，比较RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3前后，ShToll1和ShToll3蛋白对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化；同时，利用qPCR方法，分析在RNAi干扰Shtoll1和Shtoll3后，河南华溪蟹Toll信号通路下游AMPs对Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答变化。
综上所述，主要研究结果如下：
第一，河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因的序列分析与分布模式。河南华溪蟹Shtoll1全长4746bp，其中编码区(open reading frame，ORF)3033bp，可编码含1011个氨基酸的蛋白；Shtoll3全长4488bp，其中编码区3693bp，可编码含1230个氨基酸的蛋白。ShToll1和ShToll3具有典型的Toll结构，即胞外LRR重复结构、跨膜结构和胞内TIR结构。ShToll1和ShToll3胞外LRR结构符合"xLxxLxLxxNxφxxφxxxxFxx"的保守序列模式。ShToll1与大部分甲壳动物Toll1和Toll2聚为一类，ShToll3与甲壳动物Toll3聚为一类。全长序列同一性结果显示ShToll1与CmToll的同一性最高为68.59%，与DmToll3的同一性最低为22.71%；ShToll3与PtToll3的同一性最高为93.22％，与DmToll2的同一性最低为39.31%。组织分布模式结果显示ShToll主要分布在河南华溪蟹血淋巴细胞中，ShToll3主要分布在鳃组织中。
第二，建立嗜水气单胞菌攻毒模型和分析河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3基因的应答模式。嗜水气单胞菌菌株检测到了aerA、hlyA、alt、ast、ahpB、lip和fla七个毒力基因，其菌落形成单位为3.82×106cfu/mL，其与OD600的关系为y=0.191x+0.045(R2=0.973)，其攻毒河南华溪蟹的LD50为5.2×105cfu/mL。成功构建了嗜水气单胞菌攻毒河南华溪蟹的攻毒模型。嗜水气单胞菌攻毒6h后，Shtoll1在血淋巴细胞中表达量升高，攻毒3h后，Shtoll1在中肠组织中表达量升高，攻毒3、6、12h后，Shtoll1在肝胰腺组织中表达量升高；嗜水气单胞菌攻毒12h后，Shtoll3在中肠组织中表达量下降。
第三，分析河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。qPCR和免疫组化实验结果显示，在河南华溪蟹血淋巴细胞中，29mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使Shtoll1表达量升高，Shtoll1主要在血淋巴细胞中应答Cd暴露。在鳃和中肠组织中，14.5mg/L浓度Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒使ShToll3表达量升高，ShToll3主要在鳃和中肠等上皮细胞组织应答Cd暴露。免疫组化结果表明，Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒,使河南华溪蟹血淋巴细胞中ShToll1显色加深；鳃组织中ShToll3显色加深；而中肠组织中ShToll3显色无明显变化。
第四，通过功能缺失手段验证河南华溪蟹ShToll1和ShToll3基因对镉暴露和嗜水气单胞菌攻毒的应答模式。成功合成了RNAi干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3的siRNA，且在血淋巴细胞中，Shtoll1的干扰效率为90%；在鳃和中肠中，Shtoll3的干扰效率分别为68%和78%。分别干扰河南华溪蟹Shtoll1和Shtoll3后，在Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒条件下，ShToll1和ShToll3蛋白水平表达量得到抑制。干扰河南华溪蟹ShToll1后，检测到Toll信号通路下游抗菌肽alf5、alf6和c-lys可能通过Shtoll1参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答；干扰河南华溪蟹Shtoll3后，检测到Toll信号通路下游抗菌肽crustin和c-lys可能通过Shtoll3参与Cd暴露和嗜水气单胞菌攻毒的免疫应答。