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Notch信号通路是一个在进化上高度保守的信号通路,参与调控多种生理和病理过程如细胞增殖、干细胞的干性维持与分化、肿瘤发生等。Notch信号通路激活导致Notch受体发生两次切割,释放出受体胞内段结构域NICD(Notch Intracellular domain),随后NICD进入细胞核,与DNA结合蛋白CBF1结合,激活下游的靶基因转录。麻木蛋白NUMB作为内源性的细胞命运决定因子,在不对称细胞分裂过程中只被分配至一个子代细胞中,从而使得两个子代细胞发育命运不同。果蝇NUMB通过抑制Notch信号区分子细胞的命运。但在脊椎动物中,NUMB是否抑制Notch存在争议,并且在小鼠大脑皮层发育中,Numb与Notch功能失活与功能获得表现为相似的表型,而且Numb维持神经前体细胞干性的分子机制仍不清楚。我们构建了Notch信号通路成员稳定表达的HeLa细胞系,并利用这些稳定表达细胞系研究NUMB对Notch信号的影响。在稳定表达N1ICD的HeLa细胞中过表达NUMB能够抑制N1ICD降解,而且敲低NUMB会导致N1ICD的表达水平降低,但是NUMB过表达不影响Notch信号配体DLL1、JAG1和JAG2的表达水平。双荧光素酶报告实验证明NUMB能增强N1ICD介导的转录激活,并且NUMB过表达能促进293T、H4等细胞中的内源Notch信号。这些结果表明NUMB通过Notch受体正调控Notch信号。免疫共沉淀实验确认NUMB能够结合N1ICD,过表达NUMB蛋白PTB(phosphotyrosine binding)和CTD(C-terminal domain)结构域缺失的突变体仍能促进N1ICD表达,并且PTB或CTD缺失不影响NUMB与N1ICD之间的相互作用。而NUMB蛋白缺失AB(ACBD3 binding)结构域之后不能结合N1ICD,也不能促进N1ICD表达,说明NUMB蛋白通过AB结构域介导NUMB与N1ICD之间的相互作用并稳定N1ICD。CHX处理发现N1ICD的半衰期较短,而抑制蛋白酶体的活性能显著提高N1ICD的表达量,说明N1ICD主要通过泛素-蛋白酶体途径被降解。E3泛素连接酶MDM2能够结合NUMB和N1ICD,并催化N1ICD的泛素化,这种泛素化修饰能抑制N1ICD降解。但是NUMB通过抑制而N1ICD泛素化稳定N1ICD,暗示NUMB依赖其他通路调控N1ICD的稳定性。我们通过筛选去泛素化酶库发现BAP1能够结合并抑制N1ICD降解。免疫共沉淀也证明NUMB通过其PRR(proline rich)结构域结合BAP1。敲低BAP1能够回复NUMB过表达的表型,表明BAP1是NUMB下游。此外,BAP1稳定N1ICD不依赖其去泛素化酶活性,它通过抑制BRCA1-BARD1复合体的酶活性起作用。最后,应用小鼠子宫内电穿孔技术在小鼠胚胎的大脑皮层中过表达BAP1能够促进Notch信号并抑制神经元发生,这与N1ICD过表达抑制神经元发生表型相类似。而在体内敲低BAP1促进神经元发生。此外,在体外神经前体细胞中敲低BAP1抑制Notch信号并抑制神经干细胞自我更新。这些结果表明BAP1通过促进Notch信号抑制神经前体细胞分化。综上所述,本论文鉴定了一个NUMB蛋白正调控Notch信号通路的新机制,不仅为NUMB在大脑皮层发育中的功能提供了分子机制方面的解释,更加深了我们对于蛋白泛素化修饰调控Notch信号通路的理解。