【研究背景】焦虑症已成为当今世界最普遍的精神障碍,给个人和社会都带来巨大的负担。据来自欧洲人群的大样本实验调查显示,有高达33.7%的人群在人生某一时期曾遭受焦虑症的困扰;在美国,焦虑症终生患病率也在30%左右。焦虑症的发病机制非常复杂,目前尚不完全清楚。近些年的科学研究表明,大脑的边缘系统参与了情绪的调控,包含杏仁核在内的神经网络异常是焦虑症产生的病理机制之一。作为中枢神经系统最重要两种神经递质,谷氨酸和γ-氨基丁酸介导的兴奋性神经传递和抑制性神经传递(excitatory and inhibitory neurotransmission,E/I)占中枢递质传递的绝大部分。E/I传递的平衡对维持中枢系统稳态意义重大,焦虑症的产生与E/I传递长期失衡密切相关。雌激素作为女性体内最重要的性激素,除了维持女性的生殖功能以外,在中枢神经系统也发挥着重要作用。女性绝经后,情绪障碍明显增多。临床上,雌激素替代疗法(Estrogen Replacement Therapy,ERT)被用于绝经后妇女的情绪改善以及相关认知功能的提高。雌激素大多生理功能是由其经典的核受体α(Estrogen receptorα,ERα)和β(Estrogen receptorβ,ERβ)介导的基因组效应实现。ERα主要与雌激素的生殖功能有关;而ERβ与雌激素非生殖功能有关,参与雌激素介导的神经保护、突触可塑性调节、神经再生以及情绪调控等。近年来发现的g蛋白偶联受体30(gprotein-coupledreceptor30,gpr30)是一种新型的雌激素膜受体,又被称为g蛋白偶联雌激素受体(gprotein-coupledestrogenreceptor,gper)。gpr30主要位于细胞的膜结构上,介导雌激素的快速非基因组效应,该效应不依赖核转录,往往在很短的时间内激活细胞内的多种激酶,引起细胞反应。gpr30在体内分布广泛,在生殖系统、心血管系统、免疫系统以及神经系统介导雌激素的多种作用,但gpr30是否参与了雌激素对情绪的调控目前尚不清楚。研究发现,gpr30分布于海马、杏仁核以及皮层等多个与情绪调节相关的脑区,其组织分布特征提示gpr30可能参与了情绪调控。【研究目的】观察基底外侧杏仁核(basolateralamygdala,bla)gpr30受体的激活对不同因素引起的去势小鼠焦虑样行为的影响,并初步探讨其可能的机制。采用行为学,分子生物学和电生理学等手段评价gpr30受体作为抗焦虑治疗靶点的可行性,为开发新的抗焦虑药物提供相应的实验基础和理论依据。【研究方法】1.杏仁核gpr30受体表达检测小鼠麻醉状态下经心脏灌注后,断头取脑,经多聚甲醛后固定,蔗糖溶液脱水后,于冰冻切片机作冠状切片。山羊血清封闭后,gpr30抗体进行孵育,cy3标记的二抗孵育后,甘油封片于共聚焦显微镜下检查。2.小鼠卵巢摘除术(去势)小鼠腹腔注射异戊巴比妥钠麻醉后,采取俯卧式固定在手术台上,背部开口,将双侧卵巢摘除,消毒后缝合伤口。3.杏仁核bla脑立体定位小鼠腹腔注射异戊巴比妥钠麻醉后,将其固定于脑立体定位仪上,定位前卤,参照杏仁核和前卤的相对位置,定位双侧杏仁核bla,并预埋不锈钢套管,牙科水泥固定套管。4.去势小鼠应激模型的建立(1)束缚应激:将小鼠置于透气良好的束缚管中,每天束缚一次,每次2h,束缚一次或两次。(2)强迫游泳应激:将小鼠置于水深30cm,水温20±1oc的不透明圆柱状塑料桶中,每天一次,每次30min,游泳一次或两次。5.去势小鼠慢性痛模型的建立(1)慢性炎性痛模型:小鼠足底注射10μl50%的完全弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant,cfa),两周后进行痛阈值检测及相关实验(2)慢性病理性神经痛模型:采用坐骨神经慢性压迫模型(chronicconstrictioninjuryofsciaticnerve,cci),将坐骨神经暴露后,用铬制肠线作四道力度均匀的结扎,三周后进行痛阈值检测及相关实验。6.杏仁核bla药物局部微量注射采用小动物麻醉系统,小鼠持续吸入异氟烷麻醉。小心拧掉套帽,插入注射内管,连接微量注射系统,以0.5μl/min的注射速度注射1min,将相关药物或病毒注入双侧杏仁核bla,完毕后,留针1min使药物充分扩散。7.结晶紫染色确定立体定位及微量注射的位点冰冻切片机对大脑作冠状切片后,收集含有定位针道的脑片,裱在载玻片上,0.1%结晶紫染色30min,pbs漂洗后封片并于显微镜下观察。8.慢性痛小鼠痛阈值的检测对于慢性痛所致焦虑模型的小鼠进行热刺痛和机械痛痛阈值检测,采用热刺痛仪检测小鼠的热痛潜伏期,采用vonfrey纤维丝检测小鼠的机械痛痛阈。9.小鼠焦虑行为检测(1)高架十字迷宫实验(elevatedplusmazetest,epm):将小鼠头朝开臂,放在高架十字迷宫的中央区域,开启视频检测系统,记录小鼠5min内的自由活动情况,分析小鼠进入开臂次数及开臂中的活动时间。(2)旷场实验(openfieldtest,of):将小鼠放入旷场检测箱的中央区域,开启视频检测系统,记录小鼠15min内的自由活动情况,分析小鼠活动的总路程以及中央区域的活动时间。10.elisa检测应激所致焦虑小鼠各组血液及脑组织中糖皮质激素的含量。11.western-blot检测焦虑小鼠相关蛋白表达的变化,并检测药物处理对蛋白表达的影响。12.全细胞膜片钳检测焦虑小鼠兴奋性和抑制性突触传递的变化,以及药物处理的影响。【研究结果】1.gpr30受体在杏仁核bla广泛分布,并且在兴奋性神经元和抑制性神经元上均有表达;强迫游泳应激和束缚应激,均可引起去势小鼠显著的焦虑样行为,并伴有bla区gpr30表达升高。2.杏仁核bla局部注射gpr30激动剂能显著增加应激小鼠在epm开臂以及旷场中央区域的活动时间,拮抗剂能阻断激动剂的作用;未经应激处理的去势小鼠,激动剂对其行为无明显影响,而拮抗剂却可以引起焦虑样行为。3.强迫游泳应激所致焦虑小鼠模型,行为学检测时,各组小鼠血液及脑中糖皮质激素的含量没有明显差异。4.cfa所致慢性炎性痛以及cci所致慢性病理性神经痛均能引起去势小鼠明显的焦虑样行为;系统给予或杏仁核bla局部注射gpr30特异性激动剂g1能明显抑制慢性痛引起的小鼠焦虑样行为;gpr30选择性拮抗剂g15可以阻断g1的作用,预先bla局部注射gpr30shrna也可以阻断g1的抗焦虑作用。5.cfa和cci均使去势小鼠出现明显的痛敏反应,而g1和g15对慢性痛小鼠的热刺痛或者机械痛痛阈值无明显影响。6.应激或慢性痛所致焦虑小鼠,其杏仁核bla区gabaa-α2或(和)gabaa-γ2蛋白表达的降低,而谷氨酸相关受体蛋白表达升高;激动gpr30受体能够逆转上述蛋白的变化趋势,其作用可以被g15或者gpr30的shrna所阻断。7.在应激所致焦虑小鼠,gpr30受体激活能够增加杏仁核bla自发抑制性突触后电流(spontaneousinhibitorypostsynapticcurrents,sipscs)的频率和幅度,对自发兴奋性突触后电流(spontaneousexcitatorypostsynapticcurrents,sepscs)无明显影响。8.cfa诱导的焦虑小鼠杏仁核bla区sepscs频率和幅度增大,sipscs频率和幅度减小,g1处理能够逆转或部分逆转sepscs和sipscs的变化,而g15能够抑制g1的作用。【研究结论】本研究发现,应激或慢性痛均能引起去势小鼠能明显的焦虑样行为,并伴有杏仁核bla区gpr30表达的反馈性升高。激活gpr30具有显著的抗焦虑作用,其作用机制与gpr30激活能增加gabaa相关受体蛋白表达,抑制谷氨酸相关受体蛋白表达,增强杏仁核抑制性神经递质传递,减弱兴奋性神经递质传递密切相关。本研究初步阐明了杏仁核BLA区GPR30的抗焦虑作用以及其可能的机制,为开发新的抗焦虑药物提供坚实的理论基础。