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屎肠球菌(Enterococcus faecium,Efm)是医院感染的重要病原菌之一,可引起人体多部位感染,包括泌尿系统感染、血流系统感染、心内膜炎、腹膜炎、盆腔感染、皮肤和皮肤结构感染及少见的中枢系统感染。由于屎肠球菌对头孢菌素、克林霉素、复方新诺明天然耐药,对氨基糖苷类抗菌药物天然低水平耐药,对糖肽类抗菌药物可产生获得性耐药,所以治疗多重耐药的屎肠球菌感染可选择的抗菌药物极其有限,临床治疗非常棘手。目前耐万古霉素屎肠球菌(VancomycinResistant Enterococcus faecium,VREfm)有逐年增加的趋势,形势不容乐观。本研究通过对耐万古霉素屎肠球菌的耐药表型、耐药基因型、耐药转座子结构、多位点序列分型和全基因组序列进行分析,研究其遗传背景和相关耐药机制,对该菌的预防控制具有重要意义。目的:调查2015年1月到2017年7月西南医科大学附属医院和成都某院临床标本所分离的43株VREfm的耐药特征,为临床合理使用抗菌药物提供依据;分析43株VREfm耐药基因、耐药转座子结构和多位点序列分型,研究其遗传背景;分析SY1、LY19、LY22三株耐万古霉素屎肠球菌全基因组基本特征,研究其相关耐药机制。方法:(1)收集2015年1月到2017年7月西南医科大学附属医院和成都某院临床标本所分离的43株VREfm,用美国布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪重新鉴定菌种,用法国生物梅里埃VITEK2-Compact全自动微生物分析仪检测13种抗菌药物耐药情况,并用微量肉汤稀释法检测万古霉素和替考拉宁的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值,确定其耐药表型。(2)采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和sanger测序技术检测所有菌株中的VanA、Van B和VanD万古霉素耐药基因;用引物重叠PCR(overlapping PCR)方法对耐药转座子结构分析;采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)分析所有菌株的序列型(Sequence type,ST)。(3)通过第二代高通量测序技术对SY1、LY19、LY22三株VREfm进行全基因测序,原始测序结果进行拼接、组装、基因预测、基因功能注释,耐药基因和同源基因进行溯源性比较分析。结果:(1)43株VREfm对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、红霉素、克林霉素耐药率均达到100%,对利奈唑胺、替加环素、奎奴普丁/达福普汀、高浓度链霉素、四环素、高浓度庆大霉素和呋喃妥因的敏感率分别为100%、100%、97.7%、88.4%、83.7%、44.2%和4.7%。对万古霉素(Vancomycin,VAN)和替考拉宁(Teicoplanin,TEC)MIC值均较高(VAN≥64μg/ml,TEC≥32μg/ml)。(2)耐药基因检测结果显示43株VREfm均属Van A基因型。转座子Tn1546结构分为五个类型,其中B型所占比例最高79.1%(34/43),其余类型C型占9.3%(4/43),D型占7.0%(3/43),A型占2.3%(1/43),E型占2.3%(1/43),且在B型和C型有IS1216V反插入序列。MLST得到了7个ST型:ST17、ST78、ST203、ST363、ST555、ST1392、ST1394,其中ST17占74.4%(32/43),ST78占14.0%(6/43),其余5个型别各1株。7个型都属于克隆复合群17(Clonal Complex 17,CC17),ST1392、ST1394为新发现的ST型。(3)测序结果显示,VREfm SY1基因组基因序列全长2435331 bp,GC含量38.5%,共有2909个编码基因,其中24个耐药相关编码基因,独有基因家族数257个;LY19基因组基因序列全长2567058 bp,GC含量38.3%,共有3135个编码基因,其中27个耐药相关编码基因,独有基因家族数330个;LY22基因组基因序列全长2516184 bp,GC含量38.4%,共有3078个编码基因,其中29个耐药相关编码基因,独有基因家族数323个。LY19含有tetO核糖体保护蛋白基因,aad(6)氨基糖苷类腺苷转移酶基因和AAC(6’)-Ie-APH(2’’)-Ia氨基糖苷类双功能酶基因,LY22含有tetK外排汞基因,AAC(6’)-Ie-APH(2’’)-Ia氨基糖苷类双功能酶基因。结论:(1)43株VREfm均是多重耐药菌,且属于VanA表型。利奈唑胺、替加环素、奎奴普丁/达福普汀是治疗VREfm的首选。(2)43株VREfm均是VanA基因型,部分转座子有IS1216V反插入序列。所有菌株经MLST分为7个型,属于CC17克隆复合群。ST17和ST78是主要的ST型。(3)tetO、tetK是引起四环素耐药的基因,AAC(6’)-Ie-APH(2’’)-Ia和aad(6)是分别引起高浓度庆大霉素和高浓度链霉素耐药的基因。