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研究背景及意义免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种常见的自身免疫性出血疾病,占出血性疾病的1/3,发病率在儿童为3.0～5.3/10万,成年人为1.6～3.9/10万。以持续性血小板减少、血小板生成时间缩短、巨核细胞发育和成熟障碍、血小板膜糖蛋白特异性自身抗体出现为主要特征。其发病机制复杂,经典机制为由抗血小板膜糖蛋白产生的抗血小板自身抗体引起,介导网状内皮系统破坏血小板。临床上可分为急性型和慢性型,前者好发于儿童,后者多见于成人。ITP总体预后较好,但因血小板低,出血风险大,不仅影响患者的生活质量,严重时可出现颅内出血而危及生命。目前的治疗主要有肾上腺糖皮质激素、注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)、脾切除、CD20单克隆抗体、免疫抑制剂、促血小板生成素(TPO)及TPO激动剂(TPO-RA)等,但仍存在无效、效果差或价格过于昂贵或副作用明显等问题,所以目前研究者致力于新机制的研究和新药物的开发,寻找新的治疗方法成为临床急需解决的问题所在。白介素9(interleukin9,IL-9)是人类巨核细胞系M07E的生长因子,与小鼠T细胞生长因子p40有显著的同源性,主要由辅助性T细胞分泌,通过IL-9受体介导的信号转导激活JAK/STAT1,STAT3和STAT5信号通路。循环中血小板由骨髓中多能造血干细胞分化为巨核细胞而形成,其生成过程受多种细胞因子调控。研究证实,多种细胞因子(如TPO、IL-1β,IL-6,IL-1α,IL-11等)对巨核细胞增殖、分化具有调节作用。研究显示在TPO和/或干细胞因子存在下,IL-9具有增强巨核细胞扩增的作用。课题组前期研究发现成骨细胞通过IL-9调控巨核细胞的增殖和血小板的生成,目前IL-9对免疫性血小板减少症的相关影响还未见报道。本课题通过建立免疫性血小板减少症小鼠模型,检测ITP小鼠中IL-9的表达,分析IL-9对ITP小鼠血小板生成的影响,明确IL-9在ITP中的作用,探讨IL-9在ITP中应用的可行性和价值。研究内容和方法一.ITP小鼠模型构建1.模型构建方法6-8周龄雄性BALB/c小鼠16只,随机分成ITP组和对照组,ITP组腹腔注射大鼠抗小鼠CD41单克隆抗体(MWReg30单抗)建立ITP模型,注射剂量分别为:第1天、第2天68μg/kg,第3天102μg/kg,第4天至第8天136 μg/kg,对照组腹腔注射等量IgG1,连续注射8天。2.模型鉴定(1)采用尾静脉取血法采集模型小鼠外周血,每日一次,动物全血细胞分析仪检测外周血白细胞、红细胞和血小板的变化。(2)造模第8天,采集骨髓,流式细胞技术分析ITP组及对照组CD41+Sca-1+细胞和成熟巨核细胞的数量。二、ITP小鼠体内IL-9表达水平变化1.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ITP组与对照组血清IL-9的表达造模第8天,心脏采血法采集ITP组及对照组小鼠外周血,离心分离上清,酶联免疫吸附实验检测IL-9表达水平变化。2.qRT-PCR检测比较各组小鼠骨髓中IL-9 mRNA的表达造模第8天,采集ITP组及对照组小鼠骨髓,流式细胞技术分选骨髓巨核细胞,提取细胞总RNA,通过反转录、聚合酶链反应所得数据分析IL-9mRNA的相对表达量。三、探索IL-9对ITP小鼠血小板数量的影响1.实验分组:ITP+IL-9组、ITP组、对照组,其中ITP+IL-9组腹腔注射MWReg30单抗+IL-9;ITP组腹腔注射MWReg30单抗;对照组腹腔注射等量IgG1(IL-9的注射剂量为:第1天、2天7.5μg/kg,第3天11.25μg/kg,第4天至第8天15μg/kg;MWReg30单抗剂量同前)连续注射8天。2.采用尾静脉取血法采集外周血,动物全血细胞分析仪检测外周血血小板数目;采集骨髓,流式细胞技术检测成熟巨核细胞数目,通过比较ITP+IL-9组、ITP组、对照组血小板和成熟巨核细胞的数量分析IL-9对ITP发病的影响。四、初步探索IL-9影响ITP小鼠血小板生成的作用机制1.检测骨髓腔中IL-9受体的沉默效果对照组小鼠骨髓腔内注射阴性对照siRNA(10μg/只)实验组小鼠骨髓腔内注射IL-9rSiRNA(10μg/只)注射后第7天,全蛋白提取试剂盒提取骨髓细胞蛋白,蛋白免疫印迹法检测IL9R的表达。2.分析阻断IL-9/IL-9R信号通路对ITP小鼠血小板生成的影响。(1)实验分组:阴性对照组(对照组小鼠骨髓腔内注射阴性对照siRNA 10 μg/只)、ITP+IL-9+IL-9rSiRNA 组(ITP+IL-9 组小鼠骨髓腔内注射 IL-9rSiRNA 10μg/只)、ITP组;(2)注射后第7天,采用尾静脉取血法采集三组小鼠外周血,动物全血细胞分析仪检测外周血血小板的数目;(3)注射后第7天,采集三组小鼠骨髓,流式细胞技术检测成熟巨核细胞个数;3.检测信号通路关键分子的表达变化(1)采集第8天ITP+IL-9组、ITP组、对照组小鼠的骨髓细胞,提取骨髓细胞蛋白,蛋白印迹法检测分析p-STAT5的蛋白表达水平的变化。(2)采集第8天ITP+IL-9组、ITP组、对照组小鼠的骨髓细胞,流式细胞技术检测CD42d+p-STAT5+在骨髓细胞中的比例。(3)治疗第8天,取ITP+IL-9组、ITP组、对照组小鼠股骨和胫骨,经固定、脱钙、脱水、包埋、切片、烤片等处理后,行免疫荧光检测CD42d+p-STAT5+的表达。五.统计学处理与分析所有的实验都经过至少三次重复、验证,当实验结果以数值表示时,数据全部以均值±标准误(x_±SD)表示。对数据进行统计学分析时使用的软件为SPSS 19.0,两组间的统计方法采用两独立样本t检验。p<0.05代表两组在统计学上具有显著性差异。研究结果一.构建ITP模型1.鉴定ITP小鼠动物模型,经腹腔注射大鼠抗小鼠CD41单克隆抗体(MWReg30单抗)构建ITP,造模前ITP组和对照组外周血血小板计数分别为(1250.13±36.02)×109/L,(1283.25±54.71)×109/L,差异无统计学意义;24小时后ITP组和对照组血小板计数分别为:(576.50±67.58)×109/L,(1246.38±57.15)×109/L,ITP组血小板数目显著下降,有统计学意义(p<0.001),ITP小鼠模型成功构建。为检测ITP模型的稳定性,每天检测血小板计数至第8天,ITP组血小板持续维持稳定低值。造模第8天,流式细胞学技术进一步检测成熟巨核细胞数量,ITP组和对照组分别为(5.25±1.03)/10000个细胞,(15.13±1.31)/10000个细胞,ITP组成熟巨核细胞数量显著下降,差异有统计学意义(p<0.001)。二.ITP小鼠体内IL-9的表达水平变化1.酶联免疫吸附实验(ELISA)测定ITP组与对照组血清IL-9含量,结果显示:ITP组小鼠IL-9血清浓度为(13.13±0.77)pg/ml,显著低于对照组((81.76±1.91)pg/ml),有统计学意义(p<0.001)。2.qRT-PCR检测ITP组和对照组小鼠骨髓巨核细胞中IL-9 mRNA表达,结果显示ITP组的相对表达量为对照组的(0.12±0.03),ITP组IL-9 mRNA表达量明显减少,有统计学意义(p<0.001)。三、探索IL-9对ITP小鼠血小板数量的影响1.检测ITP+IL-9组、ITP组、对照组三组小鼠血常规,给药前三组血小板计数无差异。给药24小时后检测各组血小板计数,结果显示,与对照组((1246.38±57.15)×109/L)相比,ITP 组((576.50±67.58)×109/L)和 ITP+IL9组((950.00±61.35)×109/L)血小板数量均有下降,差异有统计学意义比较(p<0.001),同时发现,ITP+IL9组血小板明显高于ITP组,差异有统计学意义(p<0.001)。2.流式检测ITP+IL-9组、ITP组、对照组三组小鼠骨髓中成熟巨核细胞数目,结果显示:与对照组((15.13±1.31)/10000个细胞)相比,ITP组((5.25±1.03)/10000个细胞)和ITP+IL9组((12.28±2.21)/10000个细胞)成熟巨核细胞均有下降,ITP组与对照组差异有统计学意义(p<0.001),ITP+IL9组与对照组差异无统计学意义(p=0.086),同时发现ITP+IL9组成熟巨核细胞明显高于ITP组,差异有统计学意义(p<0.001)。四、初步探索IL-9影响ITP小鼠血小板生成的作用机制1.骨髓腔中IL-9受体的沉默效果:蛋白免疫印迹法检测IL-9R的表达,结果显示IL-9rSiRNA组IL-9R蛋白表达水平明显低于对照组。2.分析阻断IL-9/IL-9R信号通路对ITP小鼠血小板生成的影响。(1)动物全血细胞分析仪检测外周血血小板数目,结果显示:阴性对照(NC)组血小板(1186.63±60.36)×109/L,ITP+IL-9+IL-9rSiRNA 组血小板(316.5±99.51)×109/L,ITP 组血小板(310.00±40.97)×109/L,与 NC 组比较,ITP+IL-9+IL-9rSiRNA组和ITP组血小板明显下降,差异有统计学意义(p<0.001),ITP+IL-9+IL-9rSiRNA组和ITP组比较,差异无统计学意义。(2)流式检测成熟巨核细胞数量,结果显示:与NC组((15.63±2.83)/10000个细胞)比较 ITP+IL-9+IL-9rSiRNA 组((4.37±1.51)/10000 个细胞)和 ITP组((4.00±1.31)/10000个细胞)巨核细胞数量明显下降,差异有统计学意义(p<0.001),ITP+IL-9+IL-9rSiRNA组与ITP组比较,差异无统计学意义(P=0.60)。3.检测信号通路关键分子表达的变化(1)蛋白印迹法检测分析p-STAT5的蛋白表达水平,结果显示:与对照组比较,ITP+IL-9组和ITP组p-STAT5的表达量均下降,同时发现,ITP+IL-9组p-STAT5表达量高于ITP组。(2)流式细胞技术检测成熟巨核细胞p-STAT5的比值,结果显示:ITP+IL-9组(2.69± 0.34)%、ITP 组(0.65±0.18)%、对照组(6.36±1.13)%,与对照组相比,ITP+IL-9组和ITP组成熟巨核细胞p-STAT5的比值下降,差异有统计学意义(p<0.001),同时发现ITP+IL-9组成熟巨核细胞p-STAT5的比值较ITP组明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。(3)免疫荧光检测p-STAT5的表达,结果显示:ITP+IL-9组(24.63±21.77)%、ITP 组(6.63±1.41)%、对照组(29.00± 2.93)%,ITP+IL-9 组较 ITP 组CD42d+p-STAT5+表达量升高,差异有统计学意义(p<0.01)。研究结论1.ITP小鼠血清IL-9表达水平下降;2.IL-9具有促进ITP小鼠巨核细胞成熟和血小板生成的作用;3.IL-9对ITP个体发挥作用的机制,可能与通过IL9R激活JAK/STAT5信号通路有关。