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马立克氏病（Marek’s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）感染引起的一种禽类肿瘤性传染病,以诱发免疫抑制、T淋巴细胞增生为主要特征。疫苗接种是防控MD最有效的手段,但随着特超强毒株的不断出现,现有最好疫苗的保护正在被突破。因此对MDV的生物学特性,特别是逃避宿主免疫反应的病毒因子进行更广泛深入的研究,对于开发更有效的MDV疫苗具有重要意义。MDV属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科,UL43基因在α疱疹病毒中高度保守,但目前关于UL43基因表达特征及功能研究的报道均来自感染哺乳动物的疱疹病毒。MDV以鸡为主要宿主,对其UL43基因的研究尚未见报道。为了更好的研究MDV pUL43蛋白的表达特征及功能,本课题通过多肽免疫的方式制备了该蛋白多克隆抗体。通过同源重组的方式构建了表达p UL43蛋白的真核载体,转染HEK293T细胞后利用制备的多抗进行间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白免疫印迹（Western blotting）,对p UL43蛋白的表达进行检测。结果显示,p UL43蛋白在转染细胞中成功表达,呈斑块状分布在细胞核周围,其表观分子量大小与开放阅读框预测一致。通过生物信息学工具分析p UL43蛋白的跨膜结构、疏水性、亲水性和抗原性,发现该蛋白有9个跨膜结构域,N端、C端分别集中有6个和3个连续跨膜域,整体疏水性较强,仅在中间有一段长亲水结构（222～281 aa）,抗原性氨基酸分布于第1～55位和第259～276位区段。综合考虑肽段合成的难易程度,选择后者作为抗原肽。兔子经5次免疫后采集抗血清并通过亲和层析纯化浓缩多克隆抗体。利用斑点杂交对抗血清效价进行检测,结果显示,抗血清与抗原肽的反应效价为1:100 000;在转染和感染条件下,制备的多克隆抗体均能与p UL43蛋白发生特异性结合。接下来,本研究重点围绕pUL43蛋白的亚细胞定位和感染后的表达特征。为阐明N端（1～222 aa）或C端（281～419 aa）多次跨膜域是否影响p UL43蛋白的细胞定位,将表达绿色荧光蛋白的EGFP基因融合至编码全长蛋白、截短突变体序列的5’端,构建了缺失N端和C端跨膜域的p UL43截短突变体。转染细胞24 h后,观察p UL43蛋白及其截短突变体在内质网、高尔基体和细胞膜等细胞结构上的分布状况。结果显示,p UL43蛋白及截短突变体均定位于内质网和高尔基体,这提示中间的长亲水结构可能存在决定细胞定位的重要氨基酸序列。为了解不同毒力MDV感染对UL43基因表达产物的影响,分别用814疫苗株和GX20NNM1野毒株感染CEF细胞。在12、24、48、72、96、120 hpi（hours post-infection,hpi）,用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测UL43基因的m RNA表达水平;同时,再用Western blot检测p UL43蛋白的表达变化以及病毒DNA合成抑制剂膦酰乙酸（Phosphonoacetic acid,PAA）对该蛋白表达的影响。结果显示,两个毒株的UL43 m RNA和p UL43蛋白表达最早出现在12 hpi,随着感染时间的增加表达水平逐渐上升,而且PAA能明显抑制p UL43蛋白表达。两个不同毒株p UL43蛋白的表达形式相同,表观分子量均在45～50k Da。这些实验结果说明,UL43基因的m RNA和蛋白表达水平与MDV毒株的毒力无关,p UL43蛋白属于病毒感染后合成的晚期蛋白。最后,本研究还探索了pUL43蛋白对细胞表面主要相容性复合体I型（major histocompatibility complex class I,MHC-I）分子稳定性的影响。将表达p UL43全长及其截短突变体的真核载体转染DF1和HEK293T细胞,转染48 h后通过流式细胞术检测细胞表面MHC-I分子的表达水平。结果显示,p UL43全长及缺失N端、C端的截短突变体分别下调DF1细胞表面MHC-I分子至正常表达量的37.16%、20.74%和31.47%（p<0.05）。值得注意的是,p UL43蛋白不能抑制人源HEK293T细胞表面的MHC-I分子表达,这提示鸡源细胞可能存在帮助p UL43蛋白干扰MHC-I抗原递呈的特殊宿主因子。通过添加针对不同细胞过程的化学抑制剂,发现抑制剂Chloroquine、MG132能明显恢复MHC-I分子的表达,提示p UL43蛋白下调细胞表面MHC-I分子的表达可能与细胞自噬和蛋白酶体通路有关。本研究成功制备了抗pUL43蛋白的特异性多克隆抗体,在细胞水平上分析了p UL43蛋白的表达特征,并发现该蛋白能直接降低宿主细胞表面MHC-I分子的表达,这种下调作用可能依赖于细胞自噬和蛋白酶体相关的通路。