前言肺癌是一种常见的恶性肿瘤。近二十年来,肺癌在我国的发病率总体上呈上升趋势,并且随着人口老龄化和人类生活环境的污染与破坏,特别是吸烟人口的不断增加,肺癌的发病和死亡率还将继续攀升。癌细胞的器官播散是肺癌患者死亡的主要原因,临床和病理观察表明淋巴结转移是肺癌转移的早期特征,因此对肺癌侵袭和转移过程中发挥重要作用的因子的研究对于肺癌的防治具有很重要的现实意义。CCR7（CC chemokine receptor 7）是CC类趋化因子受体之一,CCL21（Chemokine ligand 21）为其配体。生理条件下,CCR7在幼稚T细胞,一些记忆T细胞,B细胞和成熟的树突状细胞表面表达;CCL21特异的高表达于淋巴结、扁桃体、及脾的T细胞富集区及淋巴内皮中;CCR7/CCL21在淋巴细胞的趋化和淋巴结归巢中起重要作用。然而近来研究发现CCR7在多种肿瘤细胞中表达,如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞癌、黑色素瘤等,并且CCR7过表达与这些肿瘤的淋巴结转移密切相关。CCR7在肿瘤侵袭转移中的作用机制日益受到关注,在乳腺癌的研究中发现,CCR7/CCL21可以通过促进肌动蛋白的聚集及伪足形成诱导肿瘤细胞趋化和侵袭;头颈部鳞癌中,CCR7/CCL21可通过PI3K/Akt信号通路促进肿瘤细胞的迁移和侵袭;通过结肠癌SW460细胞的裸鼠移植实验,发现CCR7可以诱导肿瘤内淋巴管形成。但迄今为止CCR7表达上调及其促进肿瘤内淋巴管形成机制的研究则鲜有报道。仅有文献报道脱氧氮杂胞苷可以上调黑素瘤细胞CCR7表达;内皮素能够通过内皮素受体和HIF-1上调乳腺癌MCF-7细胞CCR7表达。本研究旨在探讨缺氧对非小细胞肺癌CCR7表达影响,分析CCR7上调机制及CCR7/CCL21调控肺癌细胞迁移侵袭机制;同时本实验通过研究CCR7对淋巴管形成因子VEGF-D的表达调控作用,探讨CCR7对肺癌淋巴管形成的影响,为CCR7促进肿瘤淋巴结转移提供理论依据。材料与方法NSCLC组织标本:（1）94例组织标本均来自中国医科大学病理教研室。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理诊断医师,根据WHO肺及胸膜肿瘤分类标准（2004）和TNM分期系统（1997）,确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。94例NSCLC包括:男性60例,女性34例;年龄18～72岁（平均54岁±19岁）。鳞癌41例,腺癌53例;临床病理分期显示Ⅰ期、Ⅱ期共37例,Ⅲ期、Ⅳ期共57例;淋巴结转移56例,无淋巴结转移38例。常规病理检查手术切除的肺门、纵隔以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。（2）90例组织标本均来标本均来自1980年到2005年在中国医科大学第一附属医院实行手术的病人,患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理诊断医师,根据WHO肺及胸膜肿瘤分类标准（2004）和TNM分期系统（1997）,确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。90例NSCLC包括:年龄≤50岁者50例,≥50岁者40例;鳞癌55例,腺癌35例;临床病理分期显示Ⅰ期、Ⅱ期共39例,Ⅲ期、Ⅳ期共51例;淋巴结转移54例,无淋巴结转移36例。常规病理检查手术切除的肺门、纵隔以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。随访时间截止至2006年12月。NSCLC细胞系培养及处理:分别用含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养基,在37℃、5%CO₂的条件下培养A549,BE1,SK,QG,H661和H460肺癌细胞。细胞培养至亚融合状态后,培养基中加入抗CCR7抗体、ERK_1/2抑制剂PD98059、Akt抑制剂LY294002,使它们的终浓度为50μg/ml。缺氧处理实验中应用Cocl2模拟化学缺氧,24小时后收集细胞,提取蛋白和DNA;物理缺氧实验将细胞置于37℃、1%O₂、5%CO₂、94%N₂的条件下分别培养4h、12h、24h。细胞实验均重复3次。Western blot:收集细胞提取总蛋白。采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取等量蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和转印,一抗(anti-CCR7 1:200稀释,anti-HIF-1α1:500稀释,anti-HIF-2α1:1000稀释,anti-VEGF-D 1:300稀释,anti-ERK_1/2 1:200稀释,anti-p-ERK_1/2 1:200稀释,anti-Akt 1:300稀释,anti-p-Akt1:1000稀释,anti-β-actin 1:200稀释)4℃孵育过夜,各自对应二抗（1:3000稀释）37℃孵育2h,最后ECL发光。EC3 Imaging System凝胶成像系统采集图像,Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值,将目的蛋白与β-actin光密度比值作为相对表达量。实验至少重复3次,取平均值。免疫组化染色SP法:标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测组织中CCR7、HIF-1α、HIF-2α、VEGF-D、D2-40的蛋白表达,最后DAB显色,苏木素复染细胞核。同时以PBS代替一抗作为阴性对照。两名病理诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。结果判定:CCR7以胞浆和/或胞膜出现棕黄色颗粒视为阳性细胞;HIF-1α和HIF-2α以胞核和/或胞浆出现棕黄色颗粒视为阳性细胞;VEGF-D以胞浆出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。至少5个高倍视野下（400×）评价CCR7染色强度（1=弱,2=强）和阳性肿瘤细胞百分比（0=阴性,1.50%=1,51-75%=2,≥76%=3）。上述两项评分的乘积作为每个标本染色的最终评分,最后确定肺癌标本的染色情况分别为阴性:0分;低表达:评分≤3;或高表达:评分＞3。HIF-1α和HIF-2α染色评分同参考文献。淋巴管判定标准为:低倍光镜下确定3个淋巴管高密度区域（热点）,然后在高倍镜下分别计数每个热点中3个区域的D2-40染色阳性管腔数均值。当计数相差10%以上时则重新计数。RNA干扰:依据siRNA设计原则,选取人HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA和CCR7中的特异性核苷酸片断为靶标,应用Ambion公司在线siRNA设计软件设计HIF-1α、HIF-2α和CCR7的RNAi序列,经Blast确定所选靶向的基因是特异的,序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。实验分三组:空白对照组、非特异性siRNA转染组、特异性siRNA（20nm/L）转染组,每个实验均重复三次,转染具体步骤按Lip2000（Invitrogen,USA）试剂说明书进行。HIF-1αRNAi序列:sense5’-CUG AUG ACC AGC AAC UUG AdTdT-3’,antisense 5’-UCA AGU UGC UGGUCA UCA GdTdT-3’。HIF-2αRNAi序列:sense 5’-CAG CAU CUU UGA UAG CAGUdTdT-3’,antisense 5’-ACU GCU AUC AAA GAU GCU GdTdT-3’。HIF-1α和HIF-2α非特异性siRNA序列:sense 5’-AGU UCA ACG ACC AGU AGUCdTdT-3’,antisense 5’-GAC UAC UGG UCG UUG AdTdT-3’。CCR7 RNAi序列:sense 5’-GGACGT GCG GAA CTT TAA AdTdT-3’,antisense 5’-TTT AAA GTT CCG CAC GTCCdTdT-3’。CCR7非特异性siRNA序列:5’-GAC TTC ATA AGG CGC ATGCdTdT-3’,antisense 5’-GCA TGC GCC TTA TGAAGT CdTdT-3’。细胞转染:pLNCX2-CCR7质粒由Sam T.Hwang（National Institutes of Health,USA）惠赠。pLNCX2-CCR7质粒稳定转染CCR7低表达BE1细胞（称为CCR7-BE1）,具体转染步骤按脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书进行,含500μg/ml G418的RPMI1640筛选培养基培养转染细胞。以未转染的BE1细胞和转染空载体细胞（称为Empty vector）作为对照。Transwell细胞迁移和侵袭实验:用Matrigel基质胶包被Transwell小室后检测细胞侵袭能力。BE1和CCR7-BE1细胞分别用PD98059处理4h或抗CCR7抗体处理24h后,将2.5×10⁴个细胞接种在孔径为8μm的Transwell小室的上层,下层小室加入不同浓度的趋化因子CCL21（50,100,200,300ng/ml）,然后将细胞分别置于常氧或缺氧条件下培养24h。用棉签小心擦去膜上表面未发生迁移的细胞,迁移至膜下表面的细胞经4%多聚甲醛固定后用苏木素染色。随机选取5个视野（200×）计数迁移细胞数。实验至少3次,取平均值。细胞迁移实验在无Matrigel基质胶包被Transwell小室进行,方法同细胞侵袭试验,将细胞分别置于常氧或缺氧条件下培养8h。RT-PCR:取对数生长期的细胞用TRIZOL（Invitrogen,USA）提取总RNA。逆转录条件为30℃10 min,42℃40min,99℃5min,5℃5min。PCR反应条件为:94℃5min,94℃40sec,53℃（HIF-1α、CCR7）/60℃（HIF-2α,VEGF-*）40sec,72℃40sec,72℃5min。取扩增产物5μl,1.5%琼脂糖凝胶电泳,用Image J软件进行表达强度分析。引物均由辽宁博春天生物技术有限公司合成。PCR引物为:CCR7上游5’-GAG GCTATT GTC CCC TAAACC-3’,下游5’-TGG AGG ACA GTG AAGAAAACG-3’,304bp。HIF-1α上游5’-TAA GAAACC ACC TAT GAC CTG C-3’,下游5’-GTC GTG CTG AAT AAT ACC ACT C-3’,411bp。HIF-2α上游5’-GAAAACGAG TCC GAA GCC-3’,下游5’-CCC AAA ACC AGA GCC ATT-3’,242bp。VEGF-D上游5’-TCA GCA TCC CAT CGG TCC ACT AG-3’,下游5’-CAA CAGCCA CCA CAT CGG AAC AC-3’,223bp。β-actin上游5’-AAA TCG TGC GTGACA TTA A-3’,下游5’-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3’,513bp。统计学分析:SPSS 13.0统计学软件用于数据分析及处理。Pearson相关分析用于评价CCR7与HIF-1α、HIF-2α表达的关系。免疫组化结果应用χ²检验对蛋白表达与临床病理特征之间的关系进行分析。其它实验采用t检验;用mean±SD表示,P＜0.05为有统计学意义。实验结果1、缺氧通过HIF-1α和HIF-2α诱导CCR7表达,促进非小细胞肺癌的侵袭和转移。1.1非小细胞肺癌组织中CCR7和HIF-1α、HIF-2α表达相关:通过免疫组化方法检测94例非小细胞肺癌组织标本中CCR7和HIF-1α、HIF-2α表达。CCR7主要表达于肿瘤细胞的胞膜和（或）胞质,HIF-1α、HIF-2α蛋白则定位在肿瘤细胞的胞核和胞质。94例非小细胞肺癌组织标本中CCR7阳性率为75.53%（71/94）,HIF-1α阳性率为54.25%（51/94）,HIF-2α阳性率为70.21%（66/94）。统计学分析显示:CCR7与HIF-1α（r=0-315,P=0.002）、HIF-2α（r=0.247,P=0.017）表达呈正相关;CCR7、HIF-1α和HIF-2α表达均与非小细胞肺癌的临床病理分期(P_CCR7=0.027;P_1α=0.011;P_2α=0.015)和淋巴结转移(P_CCR7=0.001;P_1α=0.001;P_2α=0.015)呈正相关。1.2六种肺癌细胞中CCR7、HIF-1α和HIF-2αmRNA表达相关:RT-PCR方法检测六种肺癌细胞（A549、BE1、SK、QG、H661、H460）中CCR7、HIF-1α和HIF-2α表达,结果显示三者在六种肺癌细胞中均有表达,且CCR7和HIF-1α、HIF-2αmRNA表达相关,如BE1细胞中CCR7 mRNA低表达,HIF-1α和HIF-2αmRNA表达水平也明显低于其它细胞系,这表明CCR7和HIF-1α、HIF-2α表达相关是不同肺癌细胞中普遍存在的。1.3缺氧可通过诱导HIF-1α和HIF-2α上调CCR7表达:CCR7低表达的BE1细胞分别经物理缺氧（94%N2,5%CO2,1%O2）及化学缺氧（Cocl₂）处理后,通过RT-PCR和Western blotting方法检测不同时间点CCR7mRNA和蛋白表达情况,结果显示,与常氧培养相比,缺氧后CCR7表达显著上调,同时HIF-1α和HIF-2α表达也明显增加。通过siRNA方法分别抑制BE1细胞中HIF-1α（siHIF-1α）和HIF-2α（siHIF-2α）表达后,CCR7mRNA和蛋白表达水平与对照组相比明显降低（P＜0.05）。1.4缺氧通过HIF-1α/HIF-2α促进CCL21诱导的BE1细胞迁移和侵袭:缺氧培养BE1细胞后,Transwell侵袭实验检测不同浓度CCL21诱导的细胞侵袭能力。结果表明,CCL21以剂量依赖的方式诱导BE1细胞侵袭,在CCL21浓度为200ng/ml时侵袭的细胞数达到峰值;与常氧相比,不同浓度CCL21诱导细胞侵袭数均比常氧高,然而阻断HIF-1α或HIF-2α表达后,缺氧条件下CCL21诱导细胞的迁移和侵袭数目降低,尤其是干扰HIF-1α后。1.5 CCR7通过ERK_1/2促进BE1细胞迁移和侵袭:CCR7低表达的肺癌细胞BE1细胞稳定转染正义CCR7基因后,CCR7 mRNA和蛋白含量显著增加,获得CCR7高表达的细胞株CCR7-BE1细胞。CCR7-BE1经CCL21刺激后p-ERK_1/2蛋白表达水平增加,总ERK_1/2未变化;同时细胞迁移和侵袭实验中CCR7-BE1细胞通过Matrigel基质胶的细胞数目（51.29±4.89;74.57±4.69）,与空白对照组（20.57±4.2;25.43±3.99）和空质粒转染组（21.7±3.2;26±3.96）比较,迁移和侵袭细胞数目显著增多（P＜0.001）。CCR7-BE1细胞经抗CCR7抗体或ERK_1/2特异性抑制剂PD98059处理后,p-ERK_1/2表达水平降低,总ERK_1/2未变化。CCL21诱导的细胞侵袭数目也明显减少,结果表明CCR7调控BE1细胞侵袭需要ERK_1/2的活化。2、CCL21/CCR7通过ERK_1/2和Akt途径上调肺癌细胞VEGF-D表达,诱导淋巴管形成,促进肿瘤淋巴结转移。2.1 CCL21/CCR7上调肺癌细胞中VEGF-D表达:A549细胞加入趋化因子CCL21后,通过RT-PCR和Western blotting方法检测VEGF-D mRNA和蛋白表达情况,结果显示随着加药时间的增加,VEGF-D mRNA和蛋白表达显著上调。用CCR7抗体处理A549细胞后VEGF-D的蛋白表达水平降低。在三种检测的肺癌细胞系中,我们都发现了这种现象。以上研究表明CCR7可以调控非小细胞肺癌VEGF-D表达。2.2 ERK_1/2和Akt参与CCL21/CCR7介导的VEGF-D上调:肺癌A549细胞加入趋化因子CCL21后,p-ERK_1/2和p-Akt表达上调,总ERK_1/2和Akt蛋白表达却没有未改变。加入CCR7抗体阻断A549细胞中CCR7表达后,我们发现p-ERK_1/2和p-Akt表达降低。通过PD98059和LY294002分别抑制A549细胞中p-ERK_1/2和p-Akt表达后,VEGF-D mRNA和蛋白表达水平明显降低。2.3非小细胞肺癌组织中CCR7表达与VEGF-D表达水平、淋巴管密度、临床分期、淋巴结转移和患者预后相关:免疫组化方法分析90例NSCLC组织标本显示VEGF-D和CCR7表达呈正相关（r=0.455,P＜0.001）。我们通过D2-40抗体检测了CCR7和VEGF-D高或低表达的NSCLC组织中淋巴管密度。通过定量肿瘤内D2-40阳性的脉管表明,CCR7高表达组LVD为28.09±10.57,CCR7低表达组LVD为20.58±7.6,两者相比差异显著,VEGF-D高表达的肿瘤LVD（30.14±9.87）高于VEGF-D低表达的肿瘤LVD（9.38±7.22,P＜0.001）。CCR7高表达组患者与低表达组相比进展快（P=0.003）,更容易发生淋巴结转移（P=0.004）。VEGF-D高表达的患者与低表达的相比进展快（P=0.005）、易发生淋巴结转移（P=0.001）。CCR7低表达患者的生存周期要比CCR7高表达的患者长（P=0.036）。VEGF-D高表达组患者的平均生存时间为16±3.8月;95%可信区间为8.6-23.4月,明显短于VEGF-D低表达患者（P=0.009）。这些结果表明CCR7可能上调非小细胞肺癌VEGF-D表达,促进肿瘤淋巴管形成,影响肿瘤淋巴结转移,因此CCR7高表达患者预后较差。结论1、非小细胞肺癌组织标本中,CCR7与HIF-1α、HIF-2α表达呈正相关,并且它们均与非小细胞肺癌的淋巴结转移和临床病理分期密切相关。2、缺氧可通过HIF-1α和HIF-2α上调CCR7表达,CCR7表达上调后通过ERK_1/2信号通路促进肺癌细胞的迁移和侵袭,提示缺氧-HIF-1α,2α-CCR7-ERK_1/2信号通路可以调控肺癌细胞的迁移和侵袭。3、本研究证实肺癌细胞中VEGF-D是CCR7重要下游基因,CCL21/CCR7通过ERK_1/2和Akt途径上调肺癌细胞VEGF-D表达,我们还发现CCR7介导的VEGF-D上调与肺癌患者的临床分期、淋巴管密度、淋巴结转移和生存时间相关。