现代社会人体“高积累,低消耗”的活动方式成为人类健康的重大威胁。以人体内物质代谢紊乱为基本特征的代谢综合症(metabolic syndrome,MS)引发了越来越多的关注。作为危险因素的集合体,MS与心血管病的死亡率呈现正相关关系,其主要临床结局为冠心病或其它类型心血管疾病。肝脏作为人体内三大营养物质:糖,蛋白质,脂肪的重要代谢器官,其内部的稳定平衡在维持物质代谢中起到了至关重要的作用。在MS中较为常见的肝脏代谢障碍为非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),具体包括了单纯性肝脏脂肪变性,非酒精性脂肪性肝炎,肝硬化等,主要特征为肝细胞内脂质沉积及炎症反应,并与肥胖,胰岛素抵抗,MS密切相关。近年来,NAFLD已经成为西方发达国家最为常见的慢性肝脏疾病,随着我国乙肝病毒的逐步控制以及不良现代生活方式的蔓延,NAFLD亦逐步成为威胁我国公众健康的主要疾病。目前,代谢综合症与肝细胞内相关信号分子活动异常,肝脏脂肪变性等相关机制仍不清楚,导致治疗NAFLD的有效手段匮乏。因此寻找一种有效缓解NAFLD的药物,并阐明其作用机制,成为热点问题。近年来有研究发现E1A激活基因阻遏子基因(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在生物体各个器官内均广泛表达,可以参与诱发细胞成熟态,维持细胞成熟分化状态,在维持细胞稳定等方面发挥十分重要的作用。CREG在心血管疾病中的作用较为广泛,目前已经发现的作用有抗心肌缺血,抗心肌肥厚,抗炎症反应,抗凋亡以及抗纤维化等作用。而上述生物学效应在病理生理过程及信号传导通路方面都与代谢综合征及NAFLD存在一定程度的关联,基于此,我们推测CREG可能存在一定的肝细胞保护作用。本实验室的初步研究已经发现,在CREG基因全身半敲除的小鼠高脂饲养模型中可发现轻度的糖-脂代谢紊乱。因此推断CREG是可能参与NAFLD发病机制中调节糖-脂肪代谢的重要分子。本研究通过基因敲除和转基因技术研究CREG调控NAFLD的表型及机制。在研究中,我们运用了分子生物学、形态学、细胞生物学等研究方法,围绕CREG表达量与肝组织及细胞糖代谢、脂肪代谢调节关系,以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)超家族中ASK1-JNK1细胞信号转导通路在其中发挥的关键性调控作用等问题进行了探讨。为CREG基因在治疗代谢综合征-NAFLD系列疾病中的应用提供了可行的思路。本研究课题的主要研究方法和实验结果如下:1.CREG基因表达与NAFLD相关性研究首先运用分子生物学手段观察NAFLD模型后肝脏组织和细胞中CREG表达变化。结果发现NAFLD模型肝脏组织中CREG基因的m RNA以及蛋白表达均显著下调(HFD 0.43±0.04 vs NC 1.00±0.21,P<0.05 vs NC;HFD 2.68±1.04 vs NC 5.88±0.92,P<0.05 vs NC)。进一步的细胞学研究发现,原代肝细胞中CREG蛋白表达量与代表细胞脂肪累积程度的棕榈酸浓度水平呈负相关。在禁食/饱食小鼠模型研究中,禁食24小时后,脂肪代谢相关的信号蛋白PEPCK和G6Pase以及CREG蛋白的表达水平均明显下调(P<0.05 vs feed)。上述动物模型以及细胞模型实验表明,CREG基因及蛋白表达量与肝脏组织/细胞中脂肪累积量呈负相关关系。在人体肝脏标本CREG蛋白含量检测显示,与正常肝脏组织相比,NAFLD组CREG蛋白含量显著下调(NAFLD 1.00±0.25 vs normal 2.77±0.34,P<0.05)。石蜡切片CREG免疫组化研究显示,CREG主要分布于肝细胞胞浆,在NAFLD组切片染色中可见CREG蛋白表达有减少趋势。以上实验表明,肝脏细胞在细胞内脂肪累积的过程中,CREG基因表达水平以及蛋白表达水平显著下调。本部分结论为CREG基因及蛋白表达量可能与肝脏脂肪代谢水平相关。2.CREG基因表达调控NAFLD糖代谢、脂肪代谢表型研究首先将CREG肝脏特异性条件性敲除(Conditional knockout,KO),研究高脂饲养(High fat diet,HFD)情况下糖代谢表型及信号通路改变。KO后高脂饲养后,小鼠体重,肝重/体重,肝脏重量都显著增加。同时,KO组葡萄糖耐量和胰岛素耐量指标异常,空腹血糖和空腹胰岛素水平以及HOMA-IR显著增高。Western-blot分析显示KO组胰岛素信号通路相关分子Irs1/Akt,GSK3β,FOXO1磷酸化水平均显著下降。进一步的糖原染色显示糖原在KO后减少。但将CREG肝脏特异性高表达(Transgenic,TG)后,上述指标变化趋势均被翻转。以上结果表明,CREG肝脏特异性敲除后HFD可发生糖代谢紊乱,而CREG高表达(TG)可显著改善糖代谢。进一步的CREG调控脂肪代谢研究中,腹部超声显示,高脂喂养后KO组小鼠相同观察点肝脏厚度明显增加(thickness:4.97±0.25 mm vs 3.53±0.35 mm,P<0.05)。HE及油红O染色显示,KO显著增加高脂饲养条件下肝脏脂肪累积,而TG组可逆转高脂肪累积现象。同时,KO-HFD组中游离脂肪酸NEFA,总胆固醇,甘油三酯及肝功指标显著上升,而TG可显著改善上述指标。细胞学形态学实验中原代肝细胞油红O及脂肪特异性BODIPY-C16荧光染色亦证明了CREG敲除后脂肪累积加重,而高表达CREG可逆转这一趋势。脂肪代谢相关信号通路研究中,AMPK及ACC磷酸化水平与CREG表达量正相关,m TOR和p70S6K则呈负相关。接下来我们检测了糖代谢、脂肪代谢、炎症相关的基因表达水平,结果显示CREG高表达后以下基因表达量上升(ABCG1,CYP7A1,PPAR-α,CPT-1a,ACOX-1,UCP2,IL-10,PDK4),同时以下基因表达量下调(HMGCR,SREBP-1C,FAS,ACCa,CD36,FATP1,FABP1,PPAR-γ,PEPCK,G6PC,IL-1b,IL-6,TNF-α,MCP-1)。上述结果表明,CREG高表达可显著改善肝脏组织细胞内的脂肪变性,并可减轻肝脏炎症反应。上述实验证实了CREG在环境因素HFD诱发的肝脏脂肪变性的影响,同时我们也在遗传因素导致肥胖的ob/ob小鼠中验证了CREG对糖、脂肪代谢的调节作用。CREG蛋白表达量在ob/ob小鼠饲养2w,4w,8w,12w四个时间点逐渐下调。而肝脏HE及油红O染色结果显示CREG过表达可显著降低脂肪累积水平。CREG高表达显著降低血糖和血胰岛素水平,改善了ob/ob小鼠的糖代谢紊乱,同时下调了血脂水平。以上提示CREG高表达可改善ob/ob小鼠糖脂代谢紊乱。综合上述结果,CREG高表达可改善肝脏脂肪变性动物模型的糖代谢及脂肪代谢紊乱。3.CREG基因表达调控NAFLD糖代谢、脂肪代谢分子机制研究为明确CREG的具体作用机制,我们用western blotting技术同时在组织和细胞水平检测了对肝脏脂肪变性及代谢综合征起到关键作用的MAPK家族分子MEK,ERK,JNK and P38磷酸化水平,结果提示,CREG基因敲除组脂肪变性后,JNK磷酸化水平上调,过表达CREG后JNK磷酸化水平下降,其他信号分子未见明显变化。在糖、脂肪代谢表型层面,应用JNK特异性抑制剂可完全翻转CREG敲除后的脂肪变性加重趋势。同时,我们对人肝脏切片P-JNK和CREG免疫组化染色进行了相关性分析,结果发现二者呈现负相关关系(r=-0.8686,P<0.05)。上述结果提示CREG调控糖脂代谢的机制和JNK信号通路密切相关。接下来,我们进一步分析了JNK1和JNK2两个亚型在CREG调控糖脂代谢中的具体作用分工。CREG和JNK1(CREG-JNK1-dual knockout,CREG-JNK1–DKO)或JNK2(CREG-JNK2-dual knockout,CREG-JNK2–DKO)双敲除小鼠的肝脏HE及油红O染色显示,与CREG敲除后高脂饲养组相比,CREG-JNK1-DKO组肝脏脂肪累积减轻,而CREG-JNK2-DKO组无变化。同时,CREG-JNK1-DKO组翻转了CREG敲除后HFD带来的体重、肝重/体重、血糖、HOMA-IR等指标的恶化趋势,而CREG-JNK2-DKO无变化。以上提示,CREG对糖脂代谢的调控作用主要通过JNK1通路完成。为进一步研究CREG分子和JNK的作用方式,我们运用免疫共沉淀及western blotting技术验证了肝脏脂肪变性和代谢综合征中经典的信号通路ASK1-MKK4/7-JNK与CREG的共同作用。结果提示,CREG可以直接与ASK1结合并调控其磷酸化水平。同时我们利用原代肝细胞研究了CREG于P-ASK1的变化关系,ASK1磷酸化水平随着棕榈酸浓度的增加而升高,CREG与ASK1磷酸化水平呈负相关趋势。以上表明CREG通过与ASK1直接结合并调节其磷酸化水平,进而发挥其调控JNK信号通路的作用。综上所述,本课题首次发现CREG在肝脏糖代谢及脂肪代谢中的重要作用,并基本阐明了其中CREG-ASK1-JNK信号通路作用机制。首先,通过动物肝脏脂肪变性及细胞脂肪变性模型观察到细胞脂肪变性时CREG基因和蛋白表达显著下调,发现CREG基因表达可能与肝脏脂肪代谢相关;接下来,通过基因敲除技术及转基因动物模型控制肝细胞内CREG表达量,研究其对肝细胞糖及脂肪代谢的影响,发现CREG可以改善肝脏脂肪变性动物模型的糖代谢及脂肪代谢紊乱;最后,对CREG调控糖脂代谢的信号通路分析显示,CREG可通过直接与ASK1结合后调节其磷酸化水平,进而发挥其抗糖、脂肪代谢紊乱的作用。本课题首次揭示了CREG在肝脏糖代谢及脂肪代谢调控过程中的作用及对下游MAPK信号通路的调控机制,为进一步深入挖掘CREG基因的临床应用,提供了新的治疗策略和思路。