恩拉霉素是由杀真菌链霉菌产生的、由非核糖体肽合成酶催化合成的一种脂肽类抗生素,具有良好抗革兰氏阳性细菌的活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和万古霉素抗性的肠球菌(VRE)也有良好的抑菌作用,且与目前应用的抗生素没有交叉抗性。由于其水溶性较差,更多应用在饲料行业中。在饲料中添加恩拉霉素能够更好的促进动物生长,提高经济效益。因恩拉霉素存在发酵周期过长,且产量较低等问题,限制了恩拉霉素的生产与应用。因此,提高恩拉霉素产量、降低生产成本是目前迫切需要解决的问题。目前主要通过核糖体工程或者代谢工程的手段获得高产菌株。已有研究报道,通过核糖体工程的手段提高了恩拉霉素的产量,但对恩拉霉素合成代谢的调控机制至今还没有深入研究。尤其,通过操作调控基因提高恩拉霉素产量的研究国内外尚未见报道。本文通过杀真菌链霉菌产恩拉霉素发酵培养基的筛选,并摸索了杀真菌链霉菌的接合转移条件。同时,对恩拉霉素生物合成基因簇中调控基因orf22的功能进行研究,继而对恩拉霉素生物合成基因簇中双组份调控基因orf41、orf42、orf43的功能进行探讨,旨在利用代谢工程的手段提高恩拉霉素产量,为提高其饲料行业中应用价值提供依据。主要研究结果分述如下。1.杀真菌链霉菌产恩拉霉素发酵培养基的筛选及遗传操作系统的建立。通过尝试多种已报道的恩拉霉素发酵培养基、实验室搜集的链霉菌常用发酵培养基,筛选到了产量最高的发酵培养基R5α,当发酵温度为28℃,发酵时间为8d时,恩拉霉素产量为0.67±0.25 mg/L。在筛选到合适的发酵培养基的基础上,对杀真菌链霉菌的接合转移条件进行了摸索,确立了杀真菌链霉菌的接合转移条件为杀真菌链霉菌孢子浓度应控制在108个/mL左右,热激时间在10 min左右,接合转移效率大约为10-7。2.恩拉霉素生物合成基因簇中调控基因orf22的功能研究。通过对恩拉霉素生物合成基因簇进行生物信息学分析,发现了基因簇中存在可能的SARP调控基因(orf22),通过氨基酸序列比对发现Orf22与来源于灰色链霉菌的SARP家族调控蛋白StrR同源性较高(35%),但是Orf22缺少了 SARP家族常见的N端HTH结构域和转录激活结构域。已有文献报道StrR对链霉素生物合成起着转录激活的作用,推测Orf22可能也起着转录激活的作用。对该基因进行了过表达以及敲除,结果表明orf22正向调控恩拉霉素的合成,过表达orf22后恩拉霉素产量达到了 2.93±0.87 mg/L,提高了 250%。敲除orf22后菌株失去了合成恩拉霉素的能力。3.恩拉霉素生物合成基因簇中双组份调控基因orf41、orf42、orf43的功能研究。通过对恩拉霉素生物合成基因簇进行生物信息学分析还发现了基因簇中存在可能的双组份调控基因orf41、orf42、orf43,通过氨基酸序列比对发现Orf41/Orf42可能组成了一个双组份系统,该双组份系统与NarX/NarL双组份系统具有一定的同源性(20%)。分别对这3个基因进行了过表达,结果表明orf41负调控恩拉霉素的合成,过表达orf41后恩拉霉素产量降低97%左右,恩拉霉素产量为0.016±0.0002 mg/L。orf42正向调控恩拉霉素的合成,过表达orf42后恩拉霉素产量提高97%左右,恩拉霉素产量为1.68±0.15 mg/L。orf43对恩拉霉素的合成没有明显的影响。